Los bioinformadores son células microbianas vivas e intactas que han sido diseñadas genéticamente para producir una señal mensurable en respuesta a un agente químico o físico específico en su entorno . Los bioinformadores contienen dos elementos genéticos esenciales, un gen promotor y un gen informador . El gen promotor se activa ( transcribe ) cuando el agente objetivo está presente en el entorno de la célula. El gen promotor en una célula bacteriana normal está vinculado a otros genes que luego también se transcriben y luego se traducen en proteínas que ayudan a la célula a combatir o adaptarse al agente al que ha estado expuesta. En el caso de un bioinformador, estos genes, o partes de los mismos, se eliminaron y se reemplazaron con un gen informador. Como resultado, la activación del gen promotor también activa el gen informador, lo que lleva a la producción de proteínas informadoras que emiten una señal detectable. La presencia de una señal indica que el bioinformador ha detectado un agente particular en su entorno.
Originalmente desarrollados para el análisis fundamental de los factores que afectan la expresión genética , los bioinformadores se aplicaron desde el principio para la detección de contaminantes ambientales [1] y desde entonces han evolucionado hacia campos tan diversos como el diagnóstico médico , la agricultura de precisión , la garantía de la seguridad alimentaria , el seguimiento y control de procesos, y Computación biomicroelectrónica . Su versatilidad se debe al hecho de que existe una gran cantidad de sistemas de genes informadores que son capaces de generar una variedad de señales. Además, los genes indicadores se pueden insertar genéticamente en células bacterianas , de levadura , vegetales y de mamíferos , proporcionando así una funcionalidad considerable en una amplia gama de vectores hospedadores.
Hay varios tipos de genes indicadores disponibles para su uso en la construcción de organismos bioinformadores, y las señales que generan generalmente se pueden clasificar como colorimétricas , fluorescentes , luminiscentes , quimioluminiscentes o electroquímicas . Aunque cada uno funciona de manera diferente, su producto final siempre sigue siendo el mismo: una señal mensurable que es proporcional a la concentración del agente químico o físico único al que han estado expuestos. En algunos casos, la señal solo se produce cuando se agrega un sustrato secundario al bioensayo ( luxAB , Luc y aequorina). Para otros bioinformadores, la señal debe ser activada por una fuente de luz externa (GFP y UMT), y para unos pocos bioinformadores seleccionados, la señal es completamente autoinducida, sin que se requiera ningún sustrato exógeno o activación externa ( luxCDABE ). Las siguientes secciones describen brevemente algunos de los sistemas de genes informadores disponibles y sus aplicaciones existentes.
Luciferasa es el nombre genérico de una enzima que cataliza una reacción de emisión de luz. Las luciferasas se pueden encontrar en bacterias, algas, hongos, medusas, insectos, camarones y calamares, y la luz resultante que producen estos organismos se denomina bioluminiscencia. En las bacterias, los genes responsables de la reacción de emisión de luz (los genes lux ) han sido aislados y utilizados ampliamente en la construcción de bioinformadores que emiten una luz azul-verde con una intensidad máxima a 490 nm. [2] Hay tres variantes de lux disponibles, una que funciona a < 30 °C, otra a < 37 °C y una tercera a < 45 °C. El sistema genético lux consta de cinco genes, luxA , luxB , luxC , luxD y luxE . Dependiendo de la combinación de estos genes utilizados, se pueden construir varios tipos diferentes de bioinformadores bioluminiscentes .
Los bioinformadores luxAB contienen sólo los genes luxA y luxB , que juntos son responsables de generar la señal luminosa. Sin embargo, para completar completamente la reacción de emisión de luz, se debe suministrar un sustrato a la célula. Normalmente, esto ocurre mediante la adición del decanal químico en algún momento durante el procedimiento de bioensayo. Se han construido numerosos bioinformadores luxAB dentro de sistemas de células de bacterias, levaduras, insectos, nematodos, plantas y mamíferos.
En lugar de contener solo los genes luxA y luxB , los bioinformadores pueden contener los cinco genes del casete lux , lo que permite un sistema de generación de luz completamente independiente que no requiere adiciones extrañas de sustrato ni excitación por una fuente de luz externa. Entonces, en este bioensayo, el bioinformador simplemente se expone a un analito objetivo y se produce un aumento cuantitativo en la bioluminiscencia, a menudo en menos de una hora. Debido a su rapidez y facilidad de uso, junto con la capacidad de realizar el bioensayo de forma repetitiva en tiempo real y en línea, los bioinformadores luxCDABE son extremadamente atractivos. En consecuencia, se han incorporado a una amplia gama de metodologías de detección que van desde la detección de contaminantes ambientales hasta el seguimiento en tiempo real de infecciones por patógenos en ratones vivos.
Los bioinformadores de lux inespecíficos se utilizan normalmente para la detección de toxinas químicas. Por lo general, están diseñados para bioluminiscer continuamente. Tras la exposición a una toxina química, la célula muere o su actividad metabólica se retrasa, lo que provoca una disminución de los niveles de luz bioluminiscente . Su aplicación más familiar es el ensayo Microtox donde, después de una breve exposición a varias concentraciones de la muestra, la disminución de la bioluminiscencia se puede correlacionar con niveles relativos de toxicidad . [3] [4]
La luciferasa de luciérnaga cataliza una reacción que produce luz visible en el rango de 550 a 575 nm. También está disponible una luciferasa de escarabajo clic que produce luz en un pico más cercano a 595 nm. Ambas luciferasas requieren la adición de un sustrato exógeno (luciferina) para que se produzca la reacción luminosa. Se han construido numerosos bioinformadores basados en luc para la detección de una amplia gama de compuestos orgánicos e inorgánicos de interés ambiental. Sin embargo, las aplicaciones más prometedoras probablemente dependan de la introducción del código genético de la luciferasa de luciérnaga en otras células y tejidos eucariotas. [5]
La inserción de los genes luc en una línea celular de carcinoma cervical humano ( HeLa ) ilustró que la eliminación de las células tumorales se puede visualizar en un ratón vivo simplemente escaneando con una cámara de dispositivo de carga acoplada , lo que permite controlar rápidamente el tratamiento de quimioterapia en línea. y en tiempo real. [6] En otro ejemplo, los genes luc se insertaron en líneas celulares de cáncer de mama humano para desarrollar un bioensayo para la detección y medición de sustancias con potencial actividad estrogénica y antiestrogénica. [7]
Se pueden colocar promotores particulares cadena arriba del gen luc , es decir, la secuencia luc se puede fusionar con la secuencia promotora a nivel de ADN. Si dicha construcción no es demasiado grande, puede introducirse simplemente en células eucariotas utilizando plásmidos . Este enfoque se utiliza ampliamente para estudiar la actividad de un promotor determinado en un tipo de célula/tejido determinado, ya que la cantidad de luz producida por la luciferasa es directamente proporcional a la actividad del promotor. [8] Además de estudiar los promotores, los ensayos de luciferasa de luciérnaga ofrecen la opción de estudiar activadores transcripcionales : en estos experimentos normalmente se utiliza el sistema GAL4/UAS y su secuencia de ADN activadora (UAS) aguas arriba de Gal4 se coloca aguas arriba del gen luc , mientras que los diferentes Los activadores o las diferentes variantes/fragmentos del mismo activador se fusionan al módulo de unión al ADN GAL4 a nivel de proteína. De esta manera, la actividad transcripcional de las diferentes proteínas de fusión GAL4 se puede comparar directamente utilizando la luz como lectura. [9]
La aequorina es una fotoproteína aislada de la medusa bioluminiscente Aequorea victoria . Tras la adición de iones calcio (Ca2+) y coelenterazina se produce una reacción cuyo resultado es la generación de luz azul en el rango de 460 a 470 nm. La aequorina se ha incorporado a líneas de células B humanas para la detección de bacterias y virus patógenos en lo que se conoce como ensayo Cell CANARY (análisis celular y notificación de riesgos y rendimientos de antígenos). [10] Las células B están diseñadas genéticamente para producir aequorina. Al exponerse a antígenos de diferentes patógenos, las células B recombinantes emiten luz como resultado de la activación de una cascada de señalización intracelular que libera iones de calcio dentro de la célula.
La proteína verde fluorescente (GFP) también es una fotoproteína aislada y clonada de la medusa Aequorea victoria . [11] También se han aislado variantes del pensamiento marino Renilla reniformis . La GFP, al igual que la aequorina, produce una señal fluorescente azul, pero sin la necesaria adición de un sustrato exógeno. Todo lo que se necesita es una fuente de luz ultravioleta para activar las propiedades fluorescentes de la fotoproteína. Esta capacidad de autofluorescencia hace que GFP sea muy deseable en ensayos de biodetección, ya que puede usarse en línea y para monitorear células vivas intactas. Además, la capacidad de alterar la GFP para producir emisiones de luz además del azul (es decir, cian, rojo y amarillo) permite su uso como detector multianalito. En consecuencia, GFP se ha utilizado ampliamente en construcciones de bioinformadores dentro de huéspedes bacterianos, levaduras, nematodos, plantas y mamíferos.
La uroporfirinógeno (urogen) III metiltransferasa (UMT) cataliza una reacción que produce dos productos fluorescentes que producen una fluorescencia de color rojo anaranjado en el rango de 590 a 770 nm cuando se iluminan con luz ultravioleta . [12] Al igual que con GFP, no se requiere la adición de sustratos exógenos. La UMT se ha utilizado como bioinformador para la selección de plásmidos recombinantes , como marcador de la transcripción genética en células bacterianas, de levadura y de mamíferos, y para la detección de sales tóxicas como el arsenito y el antimonito .