La microscopía de contraste de interferencia diferencial ( DIC ) , también conocida como contraste de interferencia de Nomarski ( NIC ) o microscopía de Nomarski , es una técnica de microscopía óptica que se utiliza para mejorar el contraste en muestras transparentes sin teñir . DIC funciona según el principio de interferometría para obtener información sobre la longitud del camino óptico de la muestra y ver características que de otro modo serían invisibles. Un sistema óptico relativamente complejo produce una imagen en la que el objeto aparece de negro a blanco sobre un fondo gris. Esta imagen es similar a la obtenida por microscopía de contraste de fases pero sin el halo de difracción brillante. La técnica fue inventada por Francis Hughes Smith. [1] [ cita necesaria ] El "Smith DIK" fue producido por Ernst Leitz Wetzlar en Alemania y era difícil de fabricar. Luego, el físico polaco Georges Nomarski desarrolló aún más el DIC en 1952. [2]
DIC funciona separando una fuente de luz polarizada en dos partes mutuamente coherentes polarizadas ortogonalmente que se desplazan espacialmente (cortadas) en el plano de muestra y se recombinan antes de la observación. La interferencia de las dos partes en la recombinación es sensible a la diferencia de su camino óptico (es decir, el producto del índice de refracción y la longitud del camino geométrico). Al agregar una fase de compensación ajustable que determina la interferencia con una diferencia de trayectoria óptica cero en la muestra, el contraste es proporcional al gradiente de longitud de la trayectoria a lo largo de la dirección de corte, dando la apariencia de un relieve físico tridimensional correspondiente a la variación de la densidad óptica de la muestra. muestra, enfatizando líneas y bordes aunque no proporcionando una imagen topográficamente precisa.
1. La luz no polarizada ingresa al microscopio y se polariza a 45°.
2. La luz polarizada ingresa al primer prisma de Wollaston modificado por Nomarski y se separa en dos rayos polarizados a 90° entre sí, los rayos de muestreo y de referencia.
3. El condensador enfoca los dos rayos para que pasen a través de la muestra. Estos dos rayos están enfocados de modo que pasen por dos puntos adyacentes de la muestra, separados por aproximadamente 0,2 μm.
4. Los rayos viajan a través de áreas adyacentes de la muestra, separadas por el corte. La separación suele ser similar a la resolución del microscopio. Experimentarán diferentes longitudes de trayectoria óptica donde las áreas difieren en índice de refracción o espesor. Esto provoca un cambio de fase de un rayo con respecto al otro debido al retraso que experimenta la onda en el material ópticamente más denso.
5. Los rayos viajan a través de la lente del objetivo y se enfocan para el segundo prisma Wollaston modificado por Nomarski.
6. El segundo prisma recombina los dos rayos en uno polarizado a 135°. La combinación de los rayos provoca interferencias , aclarando u oscureciendo la imagen en ese punto según la diferencia de trayectoria óptica.
La imagen tiene la apariencia de un objeto tridimensional bajo una iluminación muy oblicua, provocando fuertes luces y sombras oscuras en las caras correspondientes. La dirección de la iluminación aparente está definida por la orientación de los prismas de Wollaston.
Como se explicó anteriormente, la imagen se genera a partir de dos imágenes idénticas de campo brillante que se superponen ligeramente desplazadas entre sí (típicamente alrededor de 0,2 μm), y la interferencia posterior debida a la diferencia de fase convierte los cambios de fase (y, por lo tanto, la longitud del camino óptico) en una imagen visible. cambio en la oscuridad. Esta interferencia puede ser constructiva o destructiva, dando lugar a la característica apariencia de tres dimensiones.
La diferencia de fase típica que da lugar a la interferencia es muy pequeña y muy rara vez supera los 90° (un cuarto de la longitud de onda). Esto se debe a la similitud del índice de refracción de la mayoría de las muestras y los medios en los que se encuentran: por ejemplo, una celda en agua solo tiene una diferencia de índice de refracción de alrededor de 0,05. Esta pequeña diferencia de fase es importante para el correcto funcionamiento del DIC, ya que si la diferencia de fase en la unión entre dos sustancias es demasiado grande, entonces la diferencia de fase podría alcanzar los 180° (media longitud de onda), lo que resultaría en una interferencia destructiva completa y una oscuridad anómala. región; si la diferencia de fase alcanzara los 360° (una longitud de onda completa), produciría una interferencia constructiva completa, creando una región brillante anómala.
La imagen se puede aproximar (despreciando la refracción y la absorción debidas a la muestra y el límite de resolución de la separación del haz) como el diferencial de la longitud del camino óptico con respecto a la posición a través de la muestra a lo largo del corte y, por lo tanto, el diferencial del índice de refracción (óptico). densidad) de la muestra.
El contraste se puede ajustar utilizando la fase de compensación, ya sea trasladando el prisma Nomarski objetivo o mediante una placa de ondas lambda/4 entre el polarizador y el prisma Normarski condensador (Compensación De-Senarmont). El contraste resultante va desde el campo oscuro para el desplazamiento de fase cero (intensidad proporcional al cuadrado del diferencial de corte), al relieve típico visto para la fase de ~5–90 grados, a la tinción óptica a 360 grados, donde la longitud de onda extinguida cambia con el diferencial de fase.
Cuando se recopilan imágenes desplazadas secuencialmente, el cambio de fase introducido por el objeto se puede desacoplar de artefactos no interferométricos no deseados, lo que normalmente resulta en una mejora del contraste, especialmente en muestras turbias. [3]
DIC se utiliza para obtener imágenes de muestras biológicas vivas y sin teñir, como un frotis de un cultivo de tejidos u organismos unicelulares individuales transmitidos por el agua. Debido a la iluminación espacialmente incoherente máxima, la resolución teórica se acerca a la cobertura máxima teórica dictada por la esfera de Ewald . [4] Esta es una mejora con respecto a los métodos que requieren un mayor grado de coherencia, como el contraste de fases .
Un área no biológica donde se utiliza DIC es el análisis del procesamiento de semiconductores de silicio planos. Las películas delgadas (típicamente de 100 a 1000 nm) en el procesamiento del silicio suelen ser en su mayoría transparentes a la luz visible (p. ej., dióxido de silicio, nitruro de silicio y silicio policristalino), y los defectos en ellas o la contaminación que se encuentra encima de ellas se vuelven más visibles. Esto también permite determinar si una característica es un hoyo en el material del sustrato o una masa de material extraño en la parte superior. Las características cristalinas grabadas adquieren una apariencia particularmente llamativa bajo DIC.
La calidad de la imagen, cuando se utiliza en condiciones adecuadas, es sobresaliente [ cita necesaria ] en resolución. Sin embargo, el análisis de las imágenes DIC siempre debe tener en cuenta la orientación de los prismas de Wollaston y la dirección de iluminación aparente, ya que las características paralelas a ésta no serán visibles. Sin embargo, esto se soluciona fácilmente simplemente girando la muestra y observando los cambios en la imagen.