La microscopía de contraste de interferencia diferencial ( DIC ) , también conocida como microscopía de contraste de interferencia de Nomarski ( NIC ) o microscopía Nomarski , es una técnica de microscopía óptica que se utiliza para mejorar el contraste en muestras transparentes y sin teñir . La DIC funciona según el principio de la interferometría para obtener información sobre la longitud del recorrido óptico de la muestra, para ver características que de otro modo serían invisibles. Un sistema óptico relativamente complejo produce una imagen con el objeto que aparece de negro a blanco sobre un fondo gris. Esta imagen es similar a la obtenida mediante microscopía de contraste de fase, pero sin el halo de difracción brillante. La técnica fue inventada por Francis Hughes Smith. [1] [ cita requerida ] El "Smith DIK" fue producido por Ernst Leitz Wetzlar en Alemania y era difícil de fabricar. El DIC fue desarrollado más a fondo por el físico polaco Georges Nomarski en 1952. [2]
La DIC funciona separando una fuente de luz polarizada en dos partes mutuamente coherentes y polarizadas ortogonalmente que se desplazan espacialmente (se cortan) en el plano de la muestra y se recombinan antes de la observación. La interferencia de las dos partes en la recombinación es sensible a la diferencia de trayectoria óptica (es decir, el producto del índice de refracción y la longitud de trayectoria geométrica). Al agregar una fase de compensación ajustable que determina la interferencia en la diferencia de trayectoria óptica cero en la muestra, el contraste es proporcional al gradiente de longitud de trayectoria a lo largo de la dirección de corte, lo que da la apariencia de un relieve físico tridimensional correspondiente a la variación de la densidad óptica de la muestra, enfatizando las líneas y los bordes aunque no proporciona una imagen topográficamente precisa.
1. La luz no polarizada entra al microscopio y se polariza a 45°.
2. La luz polarizada entra en el primer prisma de Wollaston modificado por Nomarski y se separa en dos rayos polarizados a 90° entre sí, los rayos de muestreo y de referencia.
3. El condensador enfoca los dos rayos para que pasen por la muestra. Estos dos rayos se enfocan de modo que pasen por dos puntos adyacentes en la muestra, separados por una distancia de aproximadamente 0,2 μm.
4. Los rayos viajan a través de áreas adyacentes de la muestra, separadas por la cizalladura. La separación normalmente es similar a la resolución del microscopio. Experimentarán diferentes longitudes de trayectoria óptica donde las áreas difieren en índice de refracción o espesor. Esto provoca un cambio en la fase de un rayo en relación con el otro debido al retraso experimentado por la onda en el material ópticamente más denso.
5. Los rayos viajan a través de la lente del objetivo y se enfocan en el segundo prisma Wollaston modificado por Nomarski.
6. El segundo prisma recombina los dos rayos en uno polarizado a 135°. La combinación de los rayos produce interferencias , aclarando u oscureciendo la imagen en ese punto según la diferencia de trayectoria óptica.
La imagen tiene la apariencia de un objeto tridimensional bajo una iluminación muy oblicua, lo que provoca una luz intensa y sombras oscuras en las caras correspondientes. La dirección de la iluminación aparente está definida por la orientación de los prismas de Wollaston.
Como se explicó anteriormente, la imagen se genera a partir de dos imágenes idénticas de campo claro superpuestas con un ligero desfase entre sí (normalmente alrededor de 0,2 μm), y la interferencia posterior debida a la diferencia de fase convierte los cambios de fase (y, por tanto, la longitud del recorrido óptico) en un cambio visible en la oscuridad. Esta interferencia puede ser constructiva o destructiva, dando lugar a la apariencia característica de tres dimensiones.
La diferencia de fase típica que da lugar a la interferencia es muy pequeña, y rara vez supera los 90° (un cuarto de la longitud de onda). Esto se debe a la similitud del índice de refracción de la mayoría de las muestras y el medio en el que se encuentran: por ejemplo, una célula en agua solo tiene una diferencia de índice de refracción de alrededor de 0,05. Esta pequeña diferencia de fase es importante para el correcto funcionamiento del DIC, ya que si la diferencia de fase en la unión entre dos sustancias es demasiado grande, la diferencia de fase podría alcanzar los 180° (la mitad de una longitud de onda), lo que daría lugar a una interferencia destructiva completa y a una región oscura anómala; si la diferencia de fase alcanzara los 360° (una longitud de onda completa), produciría una interferencia constructiva completa, creando una región brillante anómala.
La imagen se puede aproximar (sin tener en cuenta la refracción y la absorción debidas a la muestra y el límite de resolución de la separación del haz) como el diferencial de la longitud del camino óptico con respecto a la posición a lo largo de la muestra a lo largo del corte, y por lo tanto el diferencial del índice de refracción (densidad óptica) de la muestra.
El contraste se puede ajustar utilizando la fase de compensación, ya sea trasladando el prisma Nomarski del objetivo o mediante una placa de onda lambda/4 entre el polarizador y el prisma Normarski del condensador (compensación De-Senarmont). El contraste resultante va desde el campo oscuro para una compensación de fase cero (intensidad proporcional al cuadrado del diferencial de cizallamiento), hasta el relieve típico que se observa para una fase de ~5–90 grados, hasta la tinción óptica a 360 grados, donde la longitud de onda extinguida se desplaza con el diferencial de fase.
Cuando se cotejan imágenes desplazadas secuencialmente, el desplazamiento de fase introducido por el objeto se puede disociar de los artefactos no interferométricos no deseados, lo que generalmente produce una mejora en el contraste, especialmente en muestras turbias. [3]
La DIC se utiliza para obtener imágenes de muestras biológicas vivas y no teñidas, como un frotis de un cultivo de tejidos u organismos unicelulares individuales transmitidos por el agua. Debido a la iluminación espacialmente incoherente máxima, la resolución teórica se acerca a la cobertura máxima teórica dictada por la esfera de Ewald . [4] Esto supone una mejora con respecto a los métodos que requieren un mayor grado de coherencia, como el contraste de fase .
Un área no biológica en la que se utiliza la DIC es en el análisis del procesamiento de semiconductores de silicio planares. Las películas delgadas (normalmente de 100 a 1000 nm) en el procesamiento de silicio suelen ser en su mayoría transparentes a la luz visible (por ejemplo, dióxido de silicio, nitruro de silicio y silicio policristalino), y los defectos en ellas o la contaminación que se encuentra sobre ellas se hacen más visibles. Esto también permite determinar si una característica es un hoyo en el material del sustrato o una mancha de material extraño en la parte superior. Las características cristalinas grabadas adquieren un aspecto especialmente llamativo con la DIC.
La calidad de la imagen, cuando se utiliza en condiciones adecuadas, es excelente [ cita requerida ] en cuanto a resolución. Sin embargo, el análisis de imágenes DIC debe tener siempre en cuenta la orientación de los prismas de Wollaston y la dirección aparente de la iluminación, ya que las características paralelas a esta no serán visibles. Sin embargo, esto se supera fácilmente simplemente girando la muestra y observando los cambios en la imagen.