En enzimología , una alanina racemasa ( EC 5.1.1.1) es una enzima que cataliza la reacción química
Por lo tanto, esta enzima tiene un sustrato , L-alanina , y un producto , D-alanina .
Esta enzima pertenece a la familia de las isomerasas , específicamente a aquellas racemasas y epimerasas que actúan sobre aminoácidos y derivados. El nombre sistemático de esta clase de enzimas es alanina racemasa . Esta enzima también se llama L-alanina racemasa . Esta enzima participa en el metabolismo de la alanina y el aspartato y en el metabolismo de la D- alanina . Emplea un cofactor , el fosfato de piridoxal . Se sabe que al menos dos compuestos, la 3-fluoro-D-alanina y la D-cicloserina, inhiben esta enzima .
La D-alanina producida por la alanina racemasa se utiliza para la biosíntesis de peptidoglicano. El peptidoglicano se encuentra en las paredes celulares de todas las bacterias, incluidas muchas que son dañinas para los humanos. La enzima está ausente en eucariotas superiores, pero se encuentra en todas partes en procariotas, lo que hace que la alanina racemasa sea un gran objetivo para el desarrollo de fármacos antimicrobianos. [1] La alanina racemasa se puede encontrar en algunos invertebrados. [2]
Las bacterias pueden tener uno (gen alr) o dos genes de alanina racemasa. Las especies bacterianas con dos genes de alanina racemasa tienen uno que se expresa continuamente y otro que es inducible, lo que dificulta la selección de ambos genes para estudios de fármacos. Sin embargo, los estudios de eliminación han demostrado que sin la expresión del gen alr, las bacterias necesitarían una fuente externa de D-alanina para sobrevivir. Por lo tanto, el gen alr es un objetivo factible para los fármacos antimicrobianos. [1]
La alanina racemasa es la única proteína conocida, hasta 2002, que contiene una hélice α levógira de 5 aminoácidos, la hélice α levógira más larga encontrada hasta ese momento. [3]
Para catalizar la interconversión de la D y la L-alanina, la alanina racemasa debe colocar residuos capaces de intercambiar protones a ambos lados del carbono alfa de la alanina. Los estudios estructurales de los complejos enzima-inhibidor sugieren que la tirosina 265 y la lisina 39 son estos residuos. El protón alfa del enantiómero L está orientado hacia la Tyr265 y el protón alfa del enantiómero D está orientado hacia la Lys39 (Figura 1).
La distancia entre los residuos enzimáticos y los enantiómeros es de 3,5 Å y 3,6 Å respectivamente. [4] Los estudios estructurales de complejos enzimáticos con un análogo sintético de L-alanina, un inhibidor de unión fuerte [5] y propionato [6] validan aún más que Tyr265 y Lys39 son bases catalíticas para la reacción. [5] [7]
Los complejos PLP-L-Ala y PLP-D-Ala son casi superponibles. [4] Las regiones que no se superponen son los brazos conectados al anillo de piridina de PLP y al carbono alfa de la alanina. Una interacción entre los átomos de oxígeno del fosfato y nitrógeno de la piridina con la región 5'fosfopiridoxilo de PLP-Ala probablemente crea una unión fuerte con la enzima. [4]
La estructura de la alanina racemasa de Bacillus stearothermophilus (Geobacillus stearothermophilus) se determinó mediante cristalografía de rayos X con una resolución de 1,9 A. [7] El monómero de alanina racemasa está compuesto por dos dominios, un barril alfa/beta de ocho cadenas en el extremo N y un dominio C-terminal compuesto esencialmente por una cadena beta. En la Figura 2 se muestra un modelo de la estructura de dos dominios. El dominio N-terminal también se encuentra en la familia de proteínas PROSC (proline synthetase co-transcribed bacterium homolog), que no se sabe que tengan actividad de alanina racemasa. El cofactor piridoxal 5'-fosfato (PLP) se encuentra en la boca del barril alfa/beta y por encima de ella y está unido covalentemente a través de un enlace aldimina a un residuo de lisina , que se encuentra en el extremo C de la primera cadena beta del barril alfa/beta.
Los mecanismos de reacción son difíciles de probar completamente mediante experimentos. El mecanismo tradicional atribuido a una reacción de alanina racemasa es el de un mecanismo de dos bases con un intermedio carbaniónico estabilizado por PLP. El PLP se utiliza como un sumidero de electrones para estabilizar la carga negativa resultante de la desprotonación del carbono alfa. El mecanismo de dos bases favorece la especificidad de la reacción en comparación con un mecanismo de una base. El segundo residuo catalítico está preposicionado para donar un protón rápidamente después de que se forma un intermedio carbaniónico y, por lo tanto, reduce la posibilidad de que ocurran reacciones alternativas. Hay dos conflictos potenciales con este mecanismo tradicional, como identificaron Watanabe et al. Primero, Arg219 forma un enlace de hidrógeno con el nitrógeno piridínico de PLP. [7] El grupo arginina tiene un pKa de aproximadamente 12,6 y, por lo tanto, es poco probable que protone la piridina. Normalmente, en las reacciones de PLP, un residuo de aminoácido ácido, como un grupo de ácido carboxílico, con un pKa de aproximadamente 5, protona el anillo de piridina. [8] La protonación del nitrógeno de piridina permite que el nitrógeno acepte una carga negativa adicional. Por lo tanto, debido a la Arg219, es menos probable que se forme el intermedio carbanión estabilizado por PLP. Otro problema identificado fue la necesidad de otro residuo básico para devolver a Lys39 y Tyr265 a sus formas protonadas y no protonadas para L-alanina y viceversa para D-alanina. Watanabe et al. no encontraron residuos de aminoácidos o moléculas de agua, aparte del grupo carboxilato de PLP-Ala, que estuvieran lo suficientemente cerca (dentro de 4,5 A) para protonar o desprotonar Lys o Tyr. Esto se muestra en la Figura 3. [4]
Basado en las estructuras cristalinas de N-(5'-fosfopiridoxil) L-alanina (PKP-L-Ala ( y N-(5'-fosfopiridoxil) D-alanina (PLP-D-Ala)
Watanabe et al. propusieron un mecanismo alternativo en 2002, como se ve en la figura 4. En este mecanismo, los átomos de oxígeno del carboxilato de PLP-Ala participan directamente en la catálisis al mediar la transferencia de protones entre Lys39 y Tyr265. La estructura de cristalización identificó que el oxígeno del carboxilato de PLP-L-Ala al OH de Tyr265 era solo de 3,6 A y el oxígeno del carboxilato de PLP-L-Ala al nitrógeno de Lys39 era solo de 3,5 A. Por lo tanto, ambos estaban lo suficientemente cerca como para causar una reacción.
Este mecanismo se ve respaldado por mutaciones de Arg219. Las mutaciones que convierten Arg219 en un carboxilato dan como resultado la detección de un intermediario quinoide, mientras que no se detectó ninguno con la arginina. [9] El intermediario de arginina tiene mucha más energía libre y es más inestable que los mutantes de residuos ácidos. [8] La desestabilización del intermediario promueve la especificidad de la reacción. [9] [10]
