El transposón Tn3 es un elemento genético móvil de 4957 pares de bases que se encuentra en los procariotas y que codifica tres proteínas:
Tn3 es un ejemplo de transposón replicativo (transposón de tipo copiar y pegar).
Descubierta inicialmente como represora de la transposasa, la resolvasa también desempeña un papel en la facilitación de la replicación de Tn3 (Sherratt 1989).
El transposón está flanqueado por un par de repeticiones invertidas de 38 pb.
Esta primera etapa está catalizada por la transposasa.
El plásmido que contiene el transposón (el plásmido donante) se fusiona con un plásmido huésped (el plásmido diana). En el proceso, se replican el transposón y una pequeña sección del ADN huésped. El producto final es un plásmido "cointegrado" que contiene dos copias del transposón.
Shapiro (1978) [1] propuso el siguiente mecanismo para este proceso:
Los diagramas de la derecha ilustran la forma en que las posiciones de las escisiones conducen a la replicación de ciertas regiones una vez que los plásmidos se han fusionado.
Para separar las moléculas huésped y diana, la resolvasa Tn3 ejecuta una recombinación específica del sitio entre la copia antigua y la nueva del transposón en un sitio específico llamado res , que está presente en cada copia del transposón. Res tiene 114 pb de longitud y consta de 3 subsitios, a saber, los sitios I, II y III. Cada uno de estos sitios tiene diferentes longitudes (28, 34 y 25 pb, respectivamente) y están espaciados de manera desigual con 22 pb separando los sitios I y II y solo 5 pb entre los sitios II y III. Los sitios consisten en motivos repetidos invertidos de 6 pb que flanquean una secuencia central de longitud variable. Estos motivos actúan como sitios de unión para la resolvasa, de modo que cada sitio se une a un dímero de resolvasa pero con afinidad variable y probablemente una arquitectura de complejo proteína-ADN ligeramente diferente. [2] [3] Los tres subsitios son esenciales para la recombinación.
En la recombinación, dos sitios res directamente repetidos con dímeros de resolvasa unidos a cada subsitio se unen para formar una gran estructura compleja llamada sinaptosoma. La resolvasa unida a los sitios II y III inicia el ensamblaje de este complejo. En esta estructura, cuya arquitectura exacta aún no está clara, dos sitios res se entrelazan de tal manera que yuxtaponen dos copias del sitio I, lo que permite que los dímeros de resolvasa unidos a cada sitio formen un tetrámero. Nuevamente, es la interacción entre los dímeros de resolvasa unidos a los sitios accesorios (sitios II y III) y la resolvasa en el sitio I lo que hace que los dos dímeros formen sinapsis y formen un tetrámero. Una vez que se forma el tetrámero, se activa y las cadenas de ADN superior e inferior se escinden simultáneamente en el medio del sitio I con un saliente de 2 pb. El intercambio de cadenas se produce por un mecanismo aún desconocido con una rotación neta resultante de 180°. Luego del intercambio de cadenas se produce la religación (Stark et al., 1992). La recombinación entre dos sitios res repetidos directamente separa o resuelve el "cointegrado" en dos moléculas originales, cada una de las cuales contiene ahora una copia del transposón Tn3. Después de la resolución, estas dos moléculas permanecen unidas como un catenano simple de dos nodos que puede separarse fácilmente in vivo mediante una topoisomerasa de tipo II (Grindley 2002). El sistema de resolvasa de tipo salvaje requiere absolutamente un sustrato superenrollado y que los sitios de recombinación estén orientados en una repetición directa en la misma molécula de ADN. Sin embargo, se han aislado varios mutantes "desregulados" o "hiperactivos" que han perdido el requisito de los sitios accesorios. Estos mutantes son capaces de catalizar la recombinación entre dos copias del sitio I solamente, lo que básicamente reduce el tamaño del sitio de recombinación de 114 pb a solo 28 pb. [4] [5] Además, estos mutantes no tienen requisitos de superenrollamiento o conectividad (Arnold et al., 1999) y se ha demostrado que funcionan en células de mamíferos. [6] Los mutantes de resolvasa hiperactiva hasta ahora han demostrado ser útiles en la creación de resolvasas con especificidad de secuencia alterada [7] pero también en el trabajo estructural. [8]
La reacción de recombinación de resolvasa completa se puede reproducir in vitro , requiriendo solo resolvasa, un ADN sustrato y cationes multivalentes, utilizando proteína de tipo salvaje o mutantes hiperactivos. [4] [9]
Los mutantes resolvasa hiperactiva, si se desarrollan más, podrían convertirse en una alternativa a Cre y FLP , los sistemas de recombinación más utilizados en biología molecular hasta la fecha.