La transformación con cloruro de calcio ( CaCl2 ) es una técnica de laboratorio en la biología celular procariota (bacteriana) . [1] La adición de cloruro de calcio a una suspensión celular promueve la unión del ADN plasmídico a los lipopolisacáridos (LPS). Los iones de calcio cargados positivamente atraen tanto la cadena principal del ADN cargada negativamente como los grupos cargados negativamente en el núcleo interno del LPS. El ADN plasmídico puede luego pasar a la célula mediante un choque térmico , donde las células enfriadas (+4 grados Celsius) se calientan a una temperatura más alta (+42 grados Celsius) durante un corto tiempo.
En 1928, Frederick Griffith publicó el primer informe sobre el potencial de transformación de las bacterias. [2] Griffith observó que los ratones no sucumbían al tipo "rugoso" de neumococo ( Streptococcus pneumoniae ), conocido como no virulento, pero sí sucumbían a la cepa "lisa", que se conoce como virulenta. La virulencia de la cepa lisa podía suprimirse mediante la eliminación por calor. Sin embargo, cuando la cepa rugosa no virulenta se combinaba con la cepa lisa eliminada por calor, la cepa rugosa lograba adoptar el fenotipo liso y, por lo tanto, se volvía virulenta. La investigación de Griffith indicó que el cambio se debía a una sustancia no viva y termoestable generada a partir de la cepa lisa. Más tarde, Oswald Avery, Colin MacLeod y Maclyn McCarty identificaron esta sustancia transformacional como ADN en 1944. [3]
Como el ADN es una molécula muy hidrófila , a menudo no puede atravesar la membrana celular bacteriana. Por lo tanto, es necesario hacer que las bacterias sean competentes para poder internalizar el ADN . Esto se puede lograr suspendiendo las bacterias en una solución con una alta concentración de calcio , lo que crea pequeños agujeros en las células de la bacteria [ cita requerida ] . La suspensión de calcio, junto con la incubación del ADN junto con células competentes en hielo, seguida de un breve choque térmico, provocará directamente que el ADN extracromosómico entre de manera forzada en la célula. [4]
Según investigaciones anteriores, las moléculas del receptor de LPS en la superficie celular competente se unen a una molécula de ADN desnuda . [1] Esta unión se produce en vista del hecho de que las moléculas de ADN con carga negativa y el LPS forman complejos de coordinación con los cationes divalentes. Debido a su tamaño, el ADN no puede atravesar la membrana celular por sí solo para llegar al citoplasma. La membrana celular de las células tratadas con CaCl2 se despolariza gravemente durante la etapa de choque térmico y, como resultado, la caída del potencial de membrana reduce la naturaleza negativa del potencial interno de la célula, lo que permite que el ADN con carga negativa fluya hacia el interior de la célula. Posteriormente, el potencial de membrana puede volver a aumentar a su valor inicial mediante un choque de frío posterior. [4]
Las células competentes son células bacterianas con paredes celulares rediseñadas que facilitan el paso del ADN extraño. Sin tratamientos químicos o eléctricos particulares para hacerlas capaces, la mayoría de los tipos de células no pueden captar ADN con éxito , por esa razón, el tratamiento con iones de calcio es el procedimiento típico para modificar las bacterias para que sean permeables al ADN. [5] En las bacterias, la competencia está estrechamente regulada y las diferentes especies bacterianas tienen diferentes características relacionadas con la competencia. Aunque comparten algunas similitudes, las proteínas de competencia generadas por las bacterias Gram-positivas y Gram-negativas son diferentes. [6]
La competencia natural se resume en tres métodos mediante los cuales las bacterias pueden adquirir ADN de su entorno: conjugación , transformación y transducción . [7] A medida que el ADN se inserta en la célula durante la transformación, las células receptoras deben estar en cierta condición fisiológica conocida como estado competente para poder absorber el ADN transformante . [6] Una vez que el ADN ha ingresado al citoplasma de la célula, enzimas como la nucleasa pueden descomponerlo. En los casos en que el ADN es extremadamente similar al material genético de la propia célula, las enzimas reparadoras del ADN lo recombinan con el cromosoma. [8]
Evidentemente, los genes de una célula no incluyen ninguna información sobre la competencia artificial. Este tipo de competencia requiere un proceso de laboratorio que cree condiciones que no suelen existir en la naturaleza para que las células puedan volverse permeables al ADN . [9] Aunque la eficiencia de la transformación es a menudo pobre, este proceso es relativamente simple y rápido de aplicar en la ingeniería genética bacteriana. Mandel y Higa, [10] quienes crearon un procedimiento fácil basado en remojar las células en CaCl2 frío, proporcionaron las bases para obtener células competentes sintéticas. La transformación química, como la transformación con cloruro de calcio y la electroporación son los métodos más utilizados para transformar células bacterianas, como las células de E. coli , con ADN plasmídico . [5]
El tratamiento con cloruro de calcio se utiliza generalmente para la transformación de E. coli y otras bacterias. [11] Mejora la incorporación de ADN plasmídico por la célula bacteriana, promoviendo la transformación genética . El ADN plasmídico puede unirse al LPS al ser agregado a la solución celular junto con CaCl2 . [12] Por lo tanto, cuando se aplica un choque térmico, la cadena principal de ADN cargada negativamente y el LPS se combinan, lo que permite que el ADN plasmídico ingrese a la célula bacteriana. [13]
El proceso se resume en los siguientes pasos según el protocolo de The Undergraduate Journal of Experimental Microbiology and Immunology (UJEMI) :