Transferencia de energía por resonancia de Förster

Mecanismo de transferencia de energía fotoquímica

Diagrama de Jablonski de FRET con escalas de tiempo típicas indicadas. La línea discontinua negra indica un fotón virtual .

La transferencia de energía por resonancia de Förster ( FRET ), transferencia de energía por resonancia de fluorescencia , transferencia de energía por resonancia ( RET ) o transferencia de energía electrónica ( EET ) es un mecanismo que describe la transferencia de energía entre dos moléculas sensibles a la luz ( cromóforos ). ^[1] Un cromóforo donante, inicialmente en su estado electrónicamente excitado, puede transferir energía a un cromóforo aceptor a través del acoplamiento dipolo-dipolo no radiativo . ^[2] La eficiencia de esta transferencia de energía es inversamente proporcional a la sexta potencia de la distancia entre el donante y el aceptor, lo que hace que la FRET sea extremadamente sensible a pequeños cambios en la distancia. ^{[3] [4]}

Las mediciones de la eficiencia de FRET se pueden utilizar para determinar si dos fluoróforos se encuentran dentro de una cierta distancia uno del otro. ^[5] Estas mediciones se utilizan como herramienta de investigación en campos como la biología y la química.

La FRET es análoga a la comunicación de campo cercano , en el sentido de que el radio de interacción es mucho menor que la longitud de onda de la luz emitida. En la región de campo cercano, el cromóforo excitado emite un fotón virtual que es absorbido instantáneamente por un cromóforo receptor. Estos fotones virtuales son indetectables, ya que su existencia viola la conservación de la energía y el momento, y por lo tanto la FRET se conoce como un mecanismo sin radiación . Se han utilizado cálculos electrodinámicos cuánticos para determinar que la FRET sin radiación y la transferencia de energía radiativa son las asíntotas de corto y largo alcance de un único mecanismo unificado. ^{[6] [7] [8]}

Terminología

Diagrama de dibujos animados del concepto de transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET).

La transferencia de energía por resonancia de Förster recibe su nombre del científico alemán Theodor Förster . ^[9] Cuando ambos cromóforos son fluorescentes, a menudo se utiliza el término "transferencia de energía por resonancia de fluorescencia", aunque la energía no se transfiere realmente por fluorescencia . ^{[10] [11]} Para evitar una interpretación errónea del fenómeno que siempre es una transferencia de energía no radiactiva (incluso cuando ocurre entre dos cromóforos fluorescentes), se prefiere el nombre "transferencia de energía por resonancia de Förster" a "transferencia de energía por resonancia de fluorescencia"; sin embargo, este último goza de un uso común en la literatura científica. ^[12] La FRET no se limita a la fluorescencia y también ocurre en conexión con la fosforescencia. ^[10]

Fundamento teórico

La eficiencia FRET ( ) es el rendimiento cuántico de la transición de transferencia de energía, es decir, la probabilidad de que ocurra un evento de transferencia de energía por cada evento de excitación del donante: ^[13] ${\displaystyle E}$

${\displaystyle E={\frac {k_{\text{ET}}}{k_{f}+k_{\text{ET}}+\sum {k_{i}}}},}$

donde la tasa de desintegración radiativa del donante es la tasa de transferencia de energía y las tasas de cualquier otra vía de desexcitación excluyendo las transferencias de energía a otros aceptores. ^{[14] [15]} ${\displaystyle k_{f}}$ ${\displaystyle k_{\text{ET}}}$ ${\displaystyle k_{i}}$

La eficiencia de FRET depende de muchos parámetros físicos ^[16] que pueden agruparse como: 1) la distancia entre el donante y el aceptor (normalmente en el rango de 1 a 10 nm), 2) la superposición espectral del espectro de emisión del donante y el espectro de absorción del aceptor , y 3) la orientación relativa del momento dipolar de emisión del donante y el momento dipolar de absorción del aceptor.

${\displaystyle E}$depende de la distancia de separación entre donante y aceptor con una ley de sexta potencia inversa debido al mecanismo de acoplamiento dipolo-dipolo: ${\displaystyle r}$

${\displaystyle E={\frac {1}{1+(r/R_{0})^{6}}}}$

siendo la distancia de Förster de este par de donador y aceptor, es decir, la distancia a la que la eficiencia de transferencia de energía es del 50%. ^[14] La distancia de Förster depende de la integral de superposición del espectro de emisión del donador con el espectro de absorción del aceptor y su orientación molecular mutua, como se expresa mediante la siguiente ecuación, todas en unidades del SI: ^{[17] [18] [19]} ${\displaystyle R_{0}}$

${\displaystyle R_{0}^{6}={\frac {9\,\log(10)\,\kappa ^{2}\,Q_{D}\,J}{128\,\pi ^{5}\,N_{A}\,n^{4}}}}$

donde es el rendimiento cuántico de fluorescencia del donante en ausencia del aceptor, es el factor de orientación dipolar, es el índice de refracción del medio, es la constante de Avogadro y es la integral de superposición espectral calculada como ${\displaystyle Q_{\text{D}}}$ ${\displaystyle \kappa ^{2}}$ ${\displaystyle n}$ ${\displaystyle N_{\text{A}}}$ ${\displaystyle J}$

${\displaystyle J={\frac {\int f_{\text{D}}(\lambda )\epsilon _{\text{A}}(\lambda )\lambda ^{4}\,d\lambda }{\int f_{\text{D}}(\lambda )\,d\lambda }}=\int {\overline {f_{\text{D}}}}(\lambda )\epsilon _{\text{A}}(\lambda )\lambda ^{4}\,d\lambda ,}$

donde es el espectro de emisión del donante, es el espectro de emisión del donante normalizado a un área de 1, y es el coeficiente de extinción molar del aceptor , normalmente obtenido a partir de un espectro de absorción. ^[20] El factor de orientación κ se da por ${\displaystyle f_{\text{D}}}$ ${\displaystyle {\overline {f_{\text{D}}}}}$ ${\displaystyle \epsilon _{\text{A}}}$

${\displaystyle \kappa ={\hat {\mu }}_{\text{A}}\cdot {\hat {\mu }}_{\text{D}}-3({\hat {\mu }}_{\text{D}}\cdot {\hat {R}})({\hat {\mu }}_{\text{A}}\cdot {\hat {R}}),}$

donde denota el momento dipolar de transición normalizado del fluoróforo respectivo, y denota el desplazamiento interfluoróforo normalizado. ^[21] = 2/3 se supone a menudo. Este valor se obtiene cuando ambos colorantes giran libremente y se puede considerar que están orientados isótropamente durante la vida útil del estado excitado. Si cualquiera de los colorantes está fijo o no gira libremente, entonces = 2/3 no será una suposición válida. En la mayoría de los casos, sin embargo, incluso una reorientación modesta de los colorantes da como resultado un promedio de orientación suficiente que = 2/3 no da como resultado un gran error en la distancia de transferencia de energía estimada debido a la dependencia de sexta potencia de en . Incluso cuando es bastante diferente de 2/3, el error puede asociarse con un cambio en , y por lo tanto las determinaciones de cambios en la distancia relativa para un sistema particular siguen siendo válidas. Las proteínas fluorescentes no se reorientan en una escala de tiempo que sea más rápida que su vida útil de fluorescencia. En este caso 0 ≤ ≤ 4. ^[20] ${\displaystyle {\hat {\mu }}_{i}}$ ${\displaystyle {\hat {R}}}$ ${\displaystyle \kappa ^{2}}$ ${\displaystyle \kappa ^{2}}$ ${\displaystyle \kappa ^{2}}$ ${\displaystyle R_{0}}$ ${\displaystyle \kappa ^{2}}$ ${\displaystyle \kappa ^{2}}$ ${\displaystyle R_{0}}$ ${\displaystyle \kappa ^{2}}$

Las unidades de los datos no suelen estar en unidades del SI. El uso de las unidades originales para calcular la distancia de Förster suele ser más conveniente. Por ejemplo, la longitud de onda suele estar en la unidad nm y el coeficiente de extinción suele estar en la unidad , donde es la concentración . obtenida a partir de estas unidades tendrá la unidad . Para utilizar la unidad Å ( ) para , la ecuación se ajusta a ^{[17] [22] [23] [24]} ${\displaystyle M^{-1}cm^{-1}}$ ${\displaystyle M}$ ${\displaystyle mol/L}$ ${\displaystyle J}$ ${\displaystyle M^{-1}cm^{-1}nm^{4}}$ ${\displaystyle 10^{-10}m}$ ${\displaystyle R_{0}}$

${\displaystyle {R_{0}}^{6}=8.785\times 10^{-5}{\frac {\kappa ^{2}\,Q_{D}}{n^{4}}}J}$ (A ) ${\displaystyle ^{6}}$

Para los análisis dependientes del tiempo de FRET, se puede utilizar directamente la tasa de transferencia de energía ( ): ^[17] ${\displaystyle k_{\text{ET}}}$

${\displaystyle k_{\text{ET}}=({\frac {R_{0}}{r}})^{6}\,{\frac {1}{\tau _{D}}}}$

donde es el tiempo de vida de fluorescencia del donante en ausencia del aceptor. ${\displaystyle \tau _{D}}$

La eficiencia de FRET se relaciona con el rendimiento cuántico y la vida útil de fluorescencia de la molécula donante de la siguiente manera: ^[25]

${\displaystyle E=1-\tau '_{\text{D}}/\tau _{\text{D}},}$

donde y son los tiempos de vida de fluorescencia del donante en presencia y ausencia de un aceptor respectivamente, o como ${\displaystyle \tau _{\text{D}}'}$ ${\displaystyle \tau _{\text{D}}}$

${\displaystyle E=1-F_{\text{D}}'/F_{\text{D}},}$

donde y son las intensidades de fluorescencia del donante con y sin aceptor respectivamente. ${\displaystyle F_{\text{D}}'}$ ${\displaystyle F_{\text{D}}}$

Confirmación experimental de la teoría FRET

La dependencia de la distancia de sexta potencia inversa de la transferencia de energía de resonancia de Förster fue confirmada experimentalmente por Wilchek , Edelhoch y Brand ^[26] usando péptidos triptófilos. Stryer , Haugland e Yguerabide ^{[27] [ cita requerida ] [28]} también demostraron experimentalmente la dependencia teórica de la transferencia de energía de resonancia de Förster en la integral de superposición usando un indolesteroide fusionado como donante y una cetona como aceptor. Los cálculos sobre las distancias FRET de algunos pares de colorantes de ejemplo se pueden encontrar aquí. ^{[22] [24]} Sin embargo, se observaron muchas contradicciones de experimentos especiales con la teoría en un entorno complicado cuando las orientaciones y los rendimientos cuánticos de las moléculas son difíciles de estimar. ^[29]

Métodos para medir la eficiencia de FRET

En microscopía de fluorescencia , microscopía de barrido láser confocal de fluorescencia , así como en biología molecular , la FRET es una herramienta útil para cuantificar la dinámica molecular en biofísica y bioquímica , como las interacciones proteína -proteína, interacciones proteína- ADN , interacciones ADN-ADN, ^[30] y los cambios conformacionales de las proteínas. Para monitorear la formación de complejos entre dos moléculas, una de ellas se marca con un donante y la otra con un aceptor. La eficiencia de FRET se mide y se utiliza para identificar interacciones entre los complejos marcados. Hay varias formas de medir la eficiencia de FRET monitoreando los cambios en la fluorescencia emitida por el donante o el aceptor. ^[31]

Emisión sensibilizada

Un método para medir la eficiencia de la FRET es medir la variación en la intensidad de emisión del aceptor. ^[18] Cuando el donante y el aceptor están cerca (1–10 nm) debido a la interacción de las dos moléculas, la emisión del aceptor aumentará debido a la FRET intermolecular del donante al aceptor. Para monitorear los cambios conformacionales de la proteína, la proteína objetivo se marca con un donante y un aceptor en dos loci. Cuando un giro o curvatura de la proteína produce el cambio en la distancia u orientación relativa del donante y el aceptor, se observa el cambio de FRET. Si una interacción molecular o un cambio conformacional de la proteína depende de la unión del ligando , esta técnica de FRET es aplicable a los indicadores fluorescentes para la detección del ligando.

Fotoblanqueo FRET

Las eficiencias de FRET también se pueden inferir a partir de las tasas de fotoblanqueo del donante en presencia y ausencia de un aceptor. ^[18] Este método se puede realizar en la mayoría de los microscopios de fluorescencia; uno simplemente hace brillar la luz de excitación (de una frecuencia que excitará al donante pero no al aceptor significativamente) en muestras con y sin el fluoróforo aceptor y monitorea la fluorescencia del donante (típicamente separada de la fluorescencia del aceptor usando un filtro de paso de banda ) a lo largo del tiempo. La escala de tiempo es la del fotoblanqueo, que es de segundos a minutos, y la fluorescencia en cada curva se da por

${\displaystyle {\text{background}}+{\text{constant}}\cdot e^{-{\text{time}}/\tau _{\text{pb}}},}$

donde es la constante de tiempo de decaimiento por fotoblanqueo y depende de si el aceptor está presente o no. Dado que el fotoblanqueo consiste en la inactivación permanente de fluoróforos excitados, la transferencia de energía de resonancia de un fluoróforo donante excitado a un fluoróforo aceptor evita el fotoblanqueo de ese fluoróforo donante y, por lo tanto, una alta eficiencia de FRET conduce a una constante de tiempo de decaimiento por fotoblanqueo más larga: ${\displaystyle \tau _{\text{pb}}}$

${\displaystyle E=1-\tau _{\text{pb}}/\tau _{\text{pb}}',}$

donde y son las constantes de tiempo de desintegración por fotoblanqueo del donante en presencia y en ausencia del aceptor respectivamente. (Observe que la fracción es el recíproco de la utilizada para las mediciones de vida útil). ${\displaystyle \tau _{\text{pb}}'}$ ${\displaystyle \tau _{\text{pb}}}$

Esta técnica fue introducida por Jovin en 1989. ^[32] Su uso de una curva completa de puntos para extraer las constantes de tiempo puede darle ventajas de precisión sobre los otros métodos. Además, el hecho de que las mediciones de tiempo se realicen en segundos en lugar de nanosegundos hace que sea más fácil que las mediciones de la vida útil de la fluorescencia, y debido a que las tasas de decaimiento del fotoblanqueo generalmente no dependen de la concentración del donante (a menos que la saturación del aceptor sea un problema), no es necesario el control cuidadoso de las concentraciones necesarias para las mediciones de intensidad. Sin embargo, es importante mantener la iluminación igual para las mediciones con y sin aceptor, ya que el fotoblanqueo aumenta notablemente con una luz incidente más intensa.

Medidas de vida útil

La eficiencia de FRET también se puede determinar a partir del cambio en la vida útil de fluorescencia del donante. ^[18] La vida útil del donante disminuirá en presencia del aceptor. Las mediciones de la vida útil del donante FRET se utilizan en la microscopía de imágenes de vida útil de fluorescencia (FLIM).

Reacción de transferencia de calor de una sola molécula (smFRET)

smFRET es un grupo de métodos que utilizan diversas técnicas microscópicas para medir un par de fluoróforos donantes y aceptores que se excitan y detectan a nivel de molécula individual. A diferencia de la "FRET de conjunto" o la "FRET en masa", que proporciona la señal FRET de un gran número de moléculas, la FRET de molécula individual puede resolver la señal FRET de cada molécula individual. La variación de la señal smFRET es útil para revelar información cinética que una medición de conjunto no puede proporcionar, especialmente cuando el sistema está en equilibrio. También se puede observar heterogeneidad entre diferentes moléculas. Este método se ha aplicado en muchas mediciones de dinámica biomolecular, como el plegamiento/desplegamiento de ADN/ARN/proteínas y otros cambios conformacionales, y dinámica intermolecular, como la reacción, la unión, la adsorción y la desorción, que son particularmente útiles en la detección química, los bioensayos y la biodetección.

Fluoróforos utilizados para FRET

Si el enlazador está intacto, la excitación en la longitud de onda de absorbancia de CFP (414 nm) provoca la emisión por YFP (525 nm) debido a FRET. Si el enlazador es escindido por una proteasa, se elimina FRET y la emisión se produce en la longitud de onda de CFP (475 nm).

Pares CFP-YFP

Un par de fluoróforos común para uso biológico es el par de proteína fluorescente cian (CFP) y proteína fluorescente amarilla (YFP). ^[33] Ambos son variantes de color de la proteína fluorescente verde (GFP). El marcado con colorantes fluorescentes orgánicos requiere purificación, modificación química e inyección intracelular de una proteína huésped. Las variantes de GFP se pueden unir a una proteína huésped mediante ingeniería genética , lo que puede resultar más conveniente. Además, se puede utilizar una fusión de CFP e YFP ("dímero en tándem") unidas por una secuencia de escisión de proteasa como ensayo de escisión. ^[34]

Bretón

Una limitación de la FRET realizada con donantes de fluoróforos es el requisito de iluminación externa para iniciar la transferencia de fluorescencia, lo que puede provocar ruido de fondo en los resultados debido a la excitación directa del aceptor o al fotoblanqueo . Para evitar este inconveniente, se ha desarrollado la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (o BRET). ^{[35] [36] Esta técnica utiliza una} luciferasa bioluminiscente (normalmente la luciferasa de Renilla reniformis ) en lugar de CFP para producir una emisión de fotones inicial compatible con YFP.

BRET también se ha implementado utilizando una enzima luciferasa diferente, diseñada a partir del camarón de aguas profundas Oplophorus gracilirostris . Esta luciferasa es más pequeña (19 kD) y más brillante que la luciferasa más comúnmente utilizada de Renilla reniformis , ^{[37] [38 ] [39] [40]} y se ha denominado NanoLuc ^[41] o NanoKAZ. ^[42] Promega ha desarrollado un sustrato patentado para NanoLuc llamado furimazina, ^{[43] [41]} aunque también se han publicado otros sustratos valiosos de coelenterazina para NanoLuc. ^{[42] [44]} Una versión de proteína dividida de NanoLuc desarrollada por Promega ^[45] también se ha utilizado como donante de BRET en experimentos que miden las interacciones proteína-proteína. ^[46]

Homo-FRET

En general, el término "FRET" se refiere a situaciones en las que las proteínas donadoras y aceptoras (o "fluoróforos") son de dos tipos diferentes. Sin embargo, en muchas situaciones biológicas, los investigadores podrían necesitar examinar las interacciones entre dos o más proteínas del mismo tipo (o incluso la misma proteína consigo misma, por ejemplo, si la proteína se pliega o forma parte de una cadena polimérica de proteínas ^[47] o para otras cuestiones de cuantificación en células biológicas ^[48] o en experimentos in vitro . ^[49]

Obviamente, las diferencias espectrales no serán la herramienta utilizada para detectar y medir la FRET, ya que tanto la proteína aceptora como la donadora emiten luz con las mismas longitudes de onda. Sin embargo, los investigadores pueden detectar diferencias en la polarización entre la luz que excita los fluoróforos y la luz que se emite, en una técnica llamada imágenes de anisotropía de FRET; el nivel de anisotropía cuantificada (diferencia en la polarización entre los haces de excitación y emisión) se convierte entonces en una guía indicativa de cuántos eventos de FRET han ocurrido. ^[50]

En el campo de la nanofotónica, la FRET puede ser perjudicial si canaliza energía excitónica hacia sitios defectuosos, pero también es esencial para la recolección de carga en células solares orgánicas y sensibilizadas por puntos cuánticos, y se han propuesto varias estrategias habilitadas por FRET para diferentes dispositivos optoelectrónicos. Por lo tanto, es esencial comprender cómo se comportan los nanoemisores aislados cuando se apilan en una capa densa. Las nanoplaquetas son candidatas especialmente prometedoras para la difusión de excitones homo-FRET fuerte debido a su fuerte acoplamiento dipolar en el plano y su bajo desplazamiento de Stokes. ^[51] El estudio de microscopía de fluorescencia de tales cadenas individuales demostró que la transferencia de energía por FRET entre plaquetas vecinas hace que la energía se difunda en una longitud típica de 500 nm (alrededor de 80 nanoemisores), y el tiempo de transferencia entre plaquetas es del orden de 1 ps. ^[52]

Otros

Varios compuestos además de proteínas fluorescentes. ^[53]

Aplicaciones

Las aplicaciones de la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) se han expandido enormemente en los últimos 25 años, y la técnica se ha convertido en un elemento básico en muchos campos biológicos y biofísicos . La FRET se puede utilizar como una regla espectroscópica para medir la distancia y detectar interacciones moleculares en varios sistemas y tiene aplicaciones en biología y bioquímica. ^{[28] [54]}

Proteínas

La FRET se utiliza a menudo para detectar y rastrear interacciones entre proteínas. ^{[55] [56] [57] [58]} Además, la FRET se puede utilizar para medir distancias entre dominios en una sola proteína etiquetando diferentes regiones de la proteína con fluoróforos y midiendo la emisión para determinar la distancia. Esto proporciona información sobre la conformación de la proteína , incluidas las estructuras secundarias y el plegamiento de proteínas . ^{[59] [60]} Esto se extiende al seguimiento de los cambios funcionales en la estructura de la proteína, como los cambios conformacionales asociados con la actividad de la miosina . ^[61] Aplicada in vivo, la FRET se ha utilizado para detectar la ubicación y las interacciones de las estructuras celulares, incluidas las integrinas y las proteínas de membrana . ^[62]

Membranas

La FRET se puede utilizar para observar la fluidez de la membrana , el movimiento y la dispersión de las proteínas de membrana, las interacciones lípido-proteína y proteína-proteína de la membrana, y la mezcla exitosa de diferentes membranas. ^[63] La FRET también se utiliza para estudiar la formación y las propiedades de los dominios de membrana y las balsas lipídicas en las membranas celulares ^[64] y para determinar la densidad de superficie en las membranas. ^[65]

Quimiosensor

Sonda basada en FRET que se activa al interactuar con Cd2+

Las sondas basadas en FRET pueden detectar la presencia de varias moléculas: la estructura de la sonda se ve afectada por la unión o la actividad de moléculas pequeñas, que pueden activar o desactivar el sistema FRET. Esto se utiliza a menudo para detectar aniones, cationes, pequeñas moléculas sin carga y también algunas biomacromoléculas más grandes. De manera similar, los sistemas FRET se han diseñado para detectar cambios en el entorno celular debido a factores como el pH , la hipoxia o el potencial de membrana mitocondrial . ^[66]

Vías de señalización

Otro uso de FRET es en el estudio de vías metabólicas o de señalización . ^[67] Por ejemplo, FRET y BRET se han utilizado en varios experimentos para caracterizar la activación del receptor acoplado a proteína G y los mecanismos de señalización consecuentes. ^[68] Otros ejemplos incluyen el uso de FRET para analizar procesos tan diversos como la quimiotaxis bacteriana ^[69] y la actividad de la caspasa en la apoptosis . ^[70]

Cinética de plegamiento de proteínas y nucleótidos

Se han medido las dinámicas de plegamiento de proteínas, ADN, ARN y otros polímeros mediante FRET. Por lo general, estos sistemas están en equilibrio y su cinética está oculta. Sin embargo, se pueden medir midiendo la FRET de moléculas individuales con la colocación adecuada de los colorantes aceptores y donantes en las moléculas. Consulte FRET de moléculas individuales para obtener una descripción más detallada.

Otras aplicaciones

Además de los usos comunes mencionados anteriormente, FRET y BRET también son eficaces en el estudio de la cinética de reacciones bioquímicas. ^[71] FRET se utiliza cada vez más para monitorear el ensamblaje y desensamblaje dependiente del pH y es valioso en el análisis de la encapsulación de ácidos nucleicos . ^{[72] [73] [74] [75]} Esta técnica se puede utilizar para determinar los factores que afectan varios tipos de formación de nanopartículas ^{[76] [77]} así como los mecanismos y efectos de las nanomedicinas . ^[78]

Otros métodos

Un mecanismo diferente, pero relacionado, es la transferencia de electrones de Dexter .

Un método alternativo para detectar la proximidad entre proteínas es la complementación de fluorescencia bimolecular (BiFC), en la que dos partes de una proteína fluorescente se fusionan con otras proteínas. Cuando estas dos partes se encuentran, forman un fluoróforo en una escala de tiempo de minutos u horas. ^[79]

Véase también

• Transferencia de electrones de Dexter
• Acoplamiento Förster
• Transferencia de energía superficial
• Transferencia de energía de fluorescencia resuelta en el tiempo

Referencias

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Enlaces externos

• Efecto FRET en una película fina en YouTube
• Imágenes FRET (Tutorial de Becker & Hickl, sitio web)