Trazado lineal directo

Gráfico de datos cinéticos de enzimas

Gráfica lineal directa idealizada sin error experimental. Para evitar aglomeraciones y confusiones, no se indican explícitamente todas las tasas.

En bioquímica, el gráfico lineal directo es un método gráfico para los datos de cinética enzimática que sigue la ecuación de Michaelis-Menten . ^[1] En este gráfico, las observaciones no se representan como puntos, sino como líneas en el espacio de parámetros con ejes y , de modo que cada observación de una tasa a una concentración de sustrato se representa mediante una línea recta con intersección en el eje y en el eje . Idealmente (en ausencia de error experimental) las líneas se intersecan en un único punto cuyas coordenadas proporcionan los valores de y . ${\displaystyle K_{\mathrm {m} }}$ ${\displaystyle V}$ ${\displaystyle v_{i}}$ ${\displaystyle a_{i}}$ ${\displaystyle -a_{i}}$ ${\displaystyle K_{\mathrm {m} }}$ ${\displaystyle v_{i}}$ ${\displaystyle V}$ ${\displaystyle ({\hat {K}}_{\mathrm {m} },{\hat {V}})}$ ${\displaystyle {\hat {K}}_{\mathrm {m} }}$ ${\displaystyle {\hat {V}}}$

Comparación con otros gráficos de la ecuación de Michaelis-Menten

Los gráficos más conocidos de la ecuación de Michaelis-Menten, incluido el gráfico doblemente recíproco de contra , ^[2] el gráfico de Hanes de contra , ^[3] y el gráfico de Eadie-Hofstee ^{[4] [5]} de contra son todos gráficos en el espacio de observación , con cada observación representada por un punto y los parámetros determinados a partir de la pendiente y las intersecciones de las líneas resultantes. Este también es el caso de los gráficos no lineales, como el de contra , a menudo llamado erróneamente "gráfico de Michaelis-Menten", y el de contra utilizado por Michaelis y Menten. ^[6] En contraste con todos estos, el gráfico lineal directo es un gráfico en el espacio de parámetros , con observaciones representadas por líneas en lugar de puntos. ${\displaystyle 1/v}$ ${\displaystyle 1/a}$ ${\displaystyle a/v}$ ${\displaystyle a}$ ${\displaystyle v}$ ${\displaystyle v/a}$ ${\displaystyle v}$ ${\displaystyle a}$ ${\displaystyle v}$ ${\displaystyle \log a}$

Efecto del error experimental

En realidad, los puntos de intersección en un gráfico lineal directo están sujetos a un error experimental que puede ser muy grande. Para evitar la saturación, solo dos de los seis puntos de intersección están etiquetados explícitamente.

El caso ilustrado arriba es idealizado, porque ignora el efecto del error experimental . En la práctica, con las observaciones, en lugar de un único punto de intersección, hay una familia de puntos de intersección, cada uno de los cuales da una estimación separada de y para las líneas dibujadas para las observaciones de y . ^[7] Algunas de estas, cuando las líneas que se intersecan son casi paralelas, estarán sujetas a errores muy grandes, por lo que no se deben tomar las medias (ponderadas o no) como estimaciones de y . En cambio, se pueden tomar las medianas de cada conjunto como estimaciones de y . ${\displaystyle n}$ ${\displaystyle n(n-1)/2}$ ${\displaystyle K_{\mathrm {m} _{ij}}}$ ${\displaystyle V_{ij}}$ ${\displaystyle i\,\mathrm {th} }$ ${\displaystyle j\,\mathrm {th} }$ ${\displaystyle {\hat {K}}_{\mathrm {m} }}$ ${\displaystyle {\hat {V}}}$ ${\displaystyle K_{\mathrm {m} }^{*}}$ ${\displaystyle V^{*}}$

La gran mayoría de los puntos de intersección deben ocurrir en el primer cuadrante (tanto como positivo). ^{[nota 1]} Los puntos de intersección en el segundo cuadrante ( negativo y positivo) no requieren ninguna atención especial. Sin embargo, los puntos de intersección en el tercer cuadrante (tanto como negativo) no deben tomarse al pie de la letra, porque pueden ocurrir si ambos valores son lo suficientemente grandes como para acercarse a , e indican que tanto y deben tomarse como infinitos y positivos: . ^{[nota 2]} ${\displaystyle K_{\mathrm {m} _{ij}}}$ ${\displaystyle V_{ij}}$ ${\displaystyle K_{\mathrm {m} _{ij}}}$ ${\displaystyle V_{ij}}$ ${\displaystyle K_{\mathrm {m} _{ij}}}$ ${\displaystyle V_{ij}}$ ${\displaystyle v}$ ${\displaystyle V}$ ${\displaystyle K_{\mathrm {m} _{ij}}}$ ${\displaystyle V_{ij}}$ ${\displaystyle K_{\mathrm {m} _{ij}}\rightarrow +\infty ,V_{ij}\rightarrow +\infty }$

La ilustración se ha dibujado para sólo cuatro observaciones, en aras de la claridad, pero en la mayoría de las aplicaciones habrá mucho más que eso. Determinar la ubicación de las medianas mediante inspección se hace cada vez más difícil a medida que aumenta el número de observaciones, pero eso no es un problema si los datos se procesan computacionalmente. En cualquier caso, si los errores experimentales son razonablemente pequeños, como en la figura 1b de un estudio de la tirosina aminotransferasa con siete observaciones, ^[8] las líneas se amontonan lo suficientemente cerca unas de otras alrededor del punto como para que este se pueda localizar con una precisión razonable. ${\displaystyle (K_{\mathrm {m} }^{*},V^{*})}$

Resistencia a los valores atípicos y ponderación incorrecta

El principal mérito del gráfico lineal directo es que las estimaciones medianas basadas en él son altamente resistentes a la presencia de valores atípicos . Si la distribución subyacente de errores en no es estrictamente gaussiana , pero contiene una pequeña proporción de observaciones con errores anormalmente grandes, esto puede tener un efecto desastroso en muchos métodos de regresión, ya sean lineales o no lineales, pero las estimaciones medianas se ven muy poco afectadas. ^[7] ${\displaystyle v}$

Además, para obtener resultados satisfactorios, los métodos de regresión requieren una ponderación correcta: ¿los errores siguen una distribución normal con desviación estándar uniforme , coeficiente de variación uniforme o algo más? Esto rara vez se investiga, por lo que la ponderación suele basarse en preconcepciones. Atkins y Nimmo ^[9] compararon diferentes métodos de ajuste de la ecuación de Michaelis-Menten y concluyeron que ${\displaystyle \varepsilon (v)}$

Por lo tanto, hemos concluido que, a menos que se sepa con certeza que el error se distribuye normalmente y tiene una magnitud constante, el método de Eisenthal y Cornish-Bowden ^{[nota 3]} es el que se debe utilizar.

Notas

1. Si no es así, se debería considerar la posibilidad de que la ecuación de Michaelis-Menten no sea la ecuación adecuada.
2. Los elementos infinitos son, por supuesto, desastrosos para estimar un valor medio, pero mientras no sean muy numerosos no presentan ningún problema para estimar un valor mediano.
3. Se referían a la estimación de la mediana sobre la base del gráfico lineal directo.

Referencias

1. Eisenthal, Robert; Cornish-Bowden, Athel (1974). "El gráfico lineal directo: un nuevo procedimiento gráfico para estimar parámetros cinéticos enzimáticos". Biochem. J. 139 ( 3): 715–720. doi :10.1042/bj1390715. PMC 1166335.  PMID 4854723  .
2. Lineweaver, H.; Burk, D. (1934). "La determinación de las constantes de disociación enzimática". J. Amer. Chem. Soc . 56 (3): 658–666. doi :10.1021/ja01318a036.
3. Hanes, CS (1932). "Estudios sobre amilasas vegetales. I. El efecto de la concentración de almidón sobre la velocidad de hidrólisis por la amilasa de la cebada germinada". Biochem. J . 26 (2): 1406–1421. doi :10.1042/bj0261406. PMC 1261052 . PMID  16744959. 
4. Eadie, GS (1942). "La inhibición de la colinesterasa por fisostigmina y prostigmina". J. Biol. Chem . 146 (1): 85–93. doi : 10.1016/S0021-9258(18)72452-6 .
5. Hofstee, BHJ (1953). "Especificidad de las esterasas". J. Biol. Chem . 199 (1): 357–364. doi : 10.1016/S0021-9258(18)44843-0 .
6. Michaelis, L.; Menten, ML (1913). "Die Kinetik der Invertinwirkung". Bioquímica. Z.​ 49 : 333–369.
7. Cornish-Bowden, A.; Eisenthal, R. (1974). "Consideraciones estadísticas en la estimación de parámetros cinéticos enzimáticos mediante el gráfico lineal directo y otros métodos". Biochem. J. 130 ( 3): 721–730. doi :10.1042/bj1390721. PMC 1166336. PMID  4854389 . 
8. Busch, T.; Petersen, M. (2021). "La identificación y caracterización bioquímica de la tirosina aminotransferasa de Anthoceros agrestis revela el posible punto de entrada a la biosíntesis del ácido rosmarínico en las antocerotas". Planta . 253 (5): 98. doi :10.1007/s00425-021-03623-2. PMC 8041713 . PMID  33844079. 
9. Atkins, GL; Nimmo, IA (1975). "Una comparación de siete métodos para ajustar la ecuación de Michaelis-Menten". Biochem. J . 149 (3): 775–777. doi :10.1042/bj1490775. PMC 1165686 . PMID  1201002.