La ribozima de protección Lariat (anteriormente llamada ribozima ramificada GIR1 ) es una ribozima de ~ 180 nt con un aparente parecido con una ribozima del grupo I. [1] Se encuentra dentro de un tipo complejo de intrones del grupo I, también denominados intrones de ribozima gemela. [2] En lugar de empalmar , cataliza una reacción de ramificación en la que el 2' OH de un residuo interno participa en un ataque nucleofílico en un enlace fosfodiéster cercano . [3] Como resultado, el ARN se escinde en un sitio de procesamiento interno (IPS), dejando un 3'OH y un producto posterior con un lazo de 3 nt en su extremo 5'. El lazo tiene el primer y el tercer nucleótido unidos por un enlace fosfodiéster 2',5' y se lo conoce como "la tapa del lazo" porque recubre un ARNm codificado por un intrón . La tapa de lazo resultante parece contribuir al aumento de la vida media del ARNm de HE, [3] [4], confiriendo así una ventaja evolutiva al HE.
La ribozima GIR1 se descubrió originalmente durante la caracterización funcional de los intrones del ADNr extracromosómico del protista Didymium iridis . Una combinación de análisis de eliminación y autoempalme in vitro reveló una organización de intrones de ribozima gemela: dos dominios de ribozima distintos dentro del intrón. [2]
Los intrones de ribozima gemela representan algunos de los intrones organizados del grupo I más complejos conocidos y consisten en un gen de endonucleasa homing (HEG: I- Dir I endonucleasa homing) incrustado en dos dominios de ARN catalíticos funcionalmente distintos. Uno de los ARN catalíticos es una ribozima de intrón del grupo I convencional (GIR2) responsable del empalme y empalme inverso del intrón, así como de la circularización del ARN del intrón. El otro dominio de ARN catalítico es la ribozima similar al grupo I (GIR1) directamente involucrada en la maduración del ARNm de la endonucleasa homing.
In vitro , DiGIR1 cataliza tres reacciones diferentes. El primero consiste en la hidrólisis del fosfato escindible en el lugar del IPS. Esta es la reacción de escisión observada con el intrón de longitud completa y varias variantes de longitud con una velocidad relativamente baja. La escisión hidrolítica es irreversible y se considera un artefacto in vitro resultante del mal plegamiento del sitio catalítico para presentar la rama nucleotídica (BP) correctamente para la reacción. La segunda reacción, la natural, es la reacción de ramificación, en la que una transesterificación en el sitio IPS da como resultado la escisión del ARN con un 3'OH y una tapa de lazo aguas abajo formada por la unión del primer y tercer nucleótidos mediante un Enlace fosfodiéster 2'-5'. [3]
Estos productos son los únicos productos observados mediante análisis de ARN celular. [4] [5] Esta reacción de ramificación está en equilibrio con una tercera: una reacción de ligación. Es una reacción muy eficiente y tiende a enmascarar la reacción de ramificación durante los experimentos de ramificación in vitro con el intrón de longitud completa y las variantes de longitud que incluyen más de 166 nucleótidos aguas arriba del IPS.
Los modelos GIR1 se han creado utilizando datos bioquímicos y mutacionales. [6] La estructura contiene un dominio de sustrato extendido que contiene un par GoU. El par se diferencia del residuo nucleofílico de ribozima del grupo 1 típico , la región J8/7 se ha reducido. [6] Estos hallazgos proporcionan la base para un mecanismo evolutivo que explica el cambio de la ribozima de empalme del grupo I a la arquitectura ramificada GIR1. Este mecanismo podría aplicarse potencialmente a otros ARN de gran tamaño, como la ribonucleasa P. [6]
.png/1280px-The_lariat_capping_ribozyme_crystal_structure_(pdb-_4p95).png)
Recientemente se publicó la estructura cristalina de la ribozima LC. [7] En resumen, se generó un ARN ribozima permutado circularmente (CP) mediante transcripción in vitro utilizando ARN polimerasa T7. [8] Los 5' y 3' generados por permutación circular están ubicados en el sitio de escisión natural de la ribozima. Para permitir la transcripción de esta construcción, se flanquearon ribozimas de cabeza de martillo 5' optimizadas y HDV (virus retardador de la hepatitis) a la construcción LC CP. [9]
La estructura cristalina de la ribozima LC desvela cómo funciona el dominio regulador formado por P2, P2.1 y P10. Se producen dos conjuntos de interacciones terciarias para restringir P2 y P2.1, lo que permite la formación de una unión de 3 vías, que actúa como receptor para nt A209. Esta interacción de ajuste perfecto promueve la formación del sitio catalítico, siempre que el núcleo de ribozima preplegue el lazo.