La visualización de ribosomas es una técnica que se utiliza para realizar la evolución de proteínas in vitro para crear proteínas que puedan unirse a un ligando deseado . El proceso da como resultado proteínas traducidas que se asocian con su progenitor de ARNm que se utiliza, como un complejo, para unirse a un ligando inmovilizado en un paso de selección. Los híbridos de ARNm-proteína que se unen bien se transcriben luego de manera inversa a ADNc y su secuencia se amplifica mediante PCR . [1] El resultado es una secuencia de nucleótidos que se puede utilizar para crear proteínas de unión estrecha.
La visualización de los ribosomas comienza con una biblioteca nativa de secuencias de ADN que codifican polipéptidos. [2] Cada secuencia se transcribe y luego se traduce in vitro en un polipéptido. Sin embargo, la biblioteca de ADN que codifica una biblioteca particular de proteínas de unión se fusiona genéticamente a una secuencia espaciadora que carece de un codón de terminación antes de su final. La falta de un codón de terminación impide que los factores de liberación se unan y desencadenen el desmontaje del complejo traduccional. Por lo tanto, esta secuencia espaciadora permanece unida al ARNt peptidílico y ocupa el túnel ribosómico, y así permite que la proteína de interés sobresalga del ribosoma y se pliegue. El resultado es un complejo de ARNm, ribosoma y proteína que puede unirse al ligando unido a la superficie. Este complejo se estabiliza con la reducción de la temperatura y la adición de cationes como Mg 2+ .
Durante las etapas de unión o de cribado posteriores, el complejo se introduce en un ligando unido a la superficie. Esto se puede lograr de varias maneras, por ejemplo, utilizando una columna de cromatografía de afinidad con un lecho de resina que contiene ligando, una placa de 96 pocillos con ligando unido a la superficie inmovilizado o perlas magnéticas que se han recubierto con ligando. Los complejos que se unen bien se inmovilizan. La elución posterior de los aglutinantes mediante altas concentraciones de sal, agentes quelantes o ligandos móviles que forman complejos con el motivo de unión de la proteína permiten la disociación del ARNm. A continuación, el ARNm se puede transcribir de forma inversa de nuevo a ADNc, someterse a mutagénesis y alimentar iterativamente al proceso con una mayor presión selectiva para aislar aglutinantes aún mejores.
Al tener el progenitor proteico unido al complejo, los procesos de visualización de ribosomas evitan la separación de secuencias mediante microarrays /perlas peptídicas/múltiples pocillos que es común en los ensayos que implican hibridación de nucleótidos y proporciona una forma rápida de amplificar las proteínas que se unen sin descifrar la secuencia hasta que sea necesario. Al mismo tiempo, este método se basa en generar grandes grupos concentrados de diversidad de secuencias sin espacios vacíos y evitar que estas secuencias se degraden, se hibriden y reaccionen entre sí de formas que crearían espacios vacíos en el espacio de secuencias.
Tiene un historial exitoso en la ingeniería de anticuerpos [3] y proteínas terapéuticas [4] y todavía se utiliza ampliamente en estas áreas.
Los métodos competitivos para la evolución de proteínas in vitro son la visualización de fagos , la visualización de levaduras , la visualización bacteriana y la visualización de ARNm . [5] péptidos (Mattheakis, Bhatt y Dow) Como se realiza completamente in vitro, existen dos ventajas principales sobre otras tecnologías de selección. Primero, la diversidad de la biblioteca no está limitada por la eficiencia de transformación de las células bacterianas, sino solo por el número de ribosomas y diferentes moléculas de ARNm presentes en el tubo de ensayo. En segundo lugar, se pueden introducir mutaciones aleatorias fácilmente después de cada ronda de selección, ya que no es necesario transformar ninguna biblioteca después de ningún paso de diversificación. Esto permite una evolución dirigida y fácil de las proteínas de unión a lo largo de varias generaciones.
Un requisito previo para la selección de proteínas de las bibliotecas es el acoplamiento del genotipo (ARN, ADN) y el fenotipo (proteína). En la visualización de ribosomas, este enlace se logra durante la traducción in vitro mediante la estabilización del complejo que consiste en el ribosoma, el ARNm y el polipéptido naciente correctamente plegado. Los complejos ribosómicos pueden unirse a la diana inmovilizada en la superficie. Mientras que los complejos no unidos se eliminan, el ARNm de los complejos que muestran un polipéptido de unión se puede recuperar y, por lo tanto, la información genética de los polipéptidos de unión está disponible para el análisis.