Espectroscopia de resonancia magnética nuclear de carbohidratos.
La espectroscopia de RMN de carbohidratos es la aplicación de la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) al análisis estructural y conformacional de los carbohidratos . Este método permite a los científicos dilucidar la estructura de monosacáridos , oligosacáridos , polisacáridos , glicoconjugados y otros derivados de carbohidratos de fuentes sintéticas y naturales. Entre las propiedades estructurales que podrían determinarse mediante RMN se encuentran la estructura primaria (incluida la estereoquímica), la conformación de los sacáridos, la estequiometría de los sustituyentes y la proporción de sacáridos individuales en una mezcla. Los instrumentos modernos de RMN de alto campo utilizados para muestras de carbohidratos, generalmente de 500 MHz o más, pueden ejecutar un conjunto de experimentos 1D, 2D y 3D para determinar la estructura de los compuestos de carbohidratos.
Observables de RMN de carbohidratos
Cambio químico
Los rangos de desplazamiento químico comunes para los núcleos dentro de los residuos de carbohidratos son:
Los desplazamientos químicos típicos de 1 H NMR de los protones del anillo de carbohidratos son de 3 a 6 ppm (4,5 a 5,5 ppm para protones anoméricos).
Los desplazamientos químicos típicos de 13 C NMR de los carbonos del anillo de carbohidratos son de 60 a 110 ppm
En el caso de moléculas simples de mono y oligosacáridos, todas las señales de protones suelen estar separadas entre sí (normalmente con instrumentos de RMN de 500 MHz o mejores) y pueden asignarse utilizando únicamente el espectro de RMN 1D. Sin embargo, las moléculas más grandes exhiben una importante superposición de señales de protones, especialmente en la región no anomérica (3-4 ppm). La RMN de carbono 13 supera esta desventaja mediante una gama más amplia de desplazamientos químicos y técnicas especiales que permiten bloquear el acoplamiento de espín carbono-protón, haciendo así que todas las señales de carbono sean singletes altos y estrechos distinguibles entre sí.
Los rangos típicos de cambios químicos de carbono de carbohidratos específicos en los monosacáridos no sustituidos son:
Carbonos anoméricos: 90-100 ppm
Carbonos de anillos de azúcar que tienen una función hidroxi: 68-77
Carbonos de azúcar de forma abierta que tienen una función hidroxi: 71-75
Carbonos de anillos de azúcar que tienen una función amino: 50-56
Grupos hidroximetilo exocíclicos: 60-64
Grupos carboxi exocíclicos: 172-176
Carbonos del anillo de azúcar desoxigenado: 31-40
Un carbono en el cierre del anillo de piranosa: 71-73 (anómeros α), 74-76 (anómeros β)
Un carbono en el cierre del anillo de furanosa: 80-83 (anómeros α), 83-86 (anómeros β)
Constantes de acoplamiento
Las constantes de acoplamiento directo carbono-protón se utilizan para estudiar la configuración anomérica de un azúcar. Las constantes de acoplamiento protón-protón vecinales se utilizan para estudiar la estereoorientación de los protones en relación con los otros protones dentro de un anillo de azúcar, identificando así un monosacárido. Las constantes de acoplamiento heteronucleares HCOC vecinales se utilizan para estudiar ángulos de torsión a lo largo del enlace glicosídico entre azúcares o a lo largo de fragmentos exocíclicos, revelando así una conformación molecular.
Los anillos de azúcar son fragmentos moleculares relativamente rígidos, por lo que los acoplamientos protón-protón vecinales son característicos:
Ecuatorial a axial: 1–4 Hz
Ecuatorial a ecuatorial: 0–2 Hz
Axial a axial no anomérico: 9–11 Hz
Axial a axial anomérico: 7–9 Hz
Axial a hidroximetilo exocíclico: 5 Hz, 2 Hz
Geminal entre protones de hidroximetilo: 12 Hz
Efectos de Overhauser nuclear (NOE)
Los NOE son sensibles a las distancias interatómicas, lo que permite su uso como sonda conformacional o prueba de la formación de un enlace glucósido. Es una práctica común comparar los NOE protón-protón calculados con los experimentales en oligosacáridos para confirmar un mapa conformacional teórico. El cálculo de NOE implica una optimización de la geometría molecular.
Otros observables de RMN
Se informó que las relajaciones, las tasas de relajación nuclear, la forma de las líneas y otros parámetros son útiles en estudios estructurales de carbohidratos. [1]
Elucidación de la estructura de los carbohidratos mediante espectroscopia de RMN.
Parámetros estructurales de los carbohidratos.
La siguiente es una lista de características estructurales que pueden dilucidarse mediante RMN:
Estructura química de cada residuo de carbohidrato en una molécula, incluyendo
Tamaño del esqueleto carbonado y tipo de azúcar (aldosa/cetosa).
tamaño del ciclo (piranosa/furanosa/lineal)
configuración estéreo de todos los carbonos (identificación de monosacáridos)
configuración estéreo del carbono anomérico (α/β)
configuración absoluta (D/L)
Ubicación de funciones amino, carboxi, desoxi y otras.
Estructura química de residuos no carbohidratos en la molécula (aminoácidos, ácidos grasos, alcoholes, agliconas orgánicas, etc.)
Posiciones de sustitución en residuos.
Secuencia de residuos
Estequiometría de residuos terminales y cadenas laterales.
Ubicación de los enlaces fosfato y diéster sulfato.
Grado de polimerización y posicionamiento del marco (para polisacáridos)
Espectroscopia de RMN frente a otros métodos
Los métodos ampliamente conocidos de investigación estructural, como la espectrometría de masas y el análisis de rayos X, sólo son aplicables de forma limitada a los carbohidratos. [1] Estos estudios estructurales, como la determinación de secuencias o la identificación de nuevos monosacáridos, son los que más se benefician de la espectroscopia de RMN. La configuración absoluta y el grado de polimerización no siempre se pueden determinar utilizando únicamente RMN, por lo que el proceso de elucidación estructural puede requerir métodos adicionales. Aunque la composición monomérica se puede resolver mediante RMN, los métodos cromatográficos y espectroscópicos de masas proporcionan esta información a veces más fácilmente. Las otras características estructurales enumeradas anteriormente pueden determinarse únicamente mediante métodos espectroscópicos de RMN. La limitación de los estudios estructurales de carbohidratos por RMN es que la elucidación de la estructura difícilmente puede automatizarse y requiere que un experto humano derive una estructura a partir de espectros de RMN.
Aplicación de diversas técnicas de RMN a carbohidratos.
Los glicanos complejos poseen una multitud de señales superpuestas, especialmente en un espectro de protones. Por tanto, resulta ventajoso utilizar experimentos 2D para la asignación de señales. La tabla y las figuras siguientes enumeran las técnicas de RMN más utilizadas en estudios de carbohidratos.
Técnicas de RMN heteronuclear en estudios de carbohidratos, y átomos típicos intraresiduos (rojo) e interresiduos (azul) que se unen entre sí.Técnicas de RMN homonuclear en estudios de carbohidratos, y átomos típicos intraresiduos (rojo) e interresiduos (azul) que se unen entre sí.
Esquema de investigación
La investigación espectroscópica de RMN incluye los siguientes pasos:
Extracción de material de carbohidratos (para glicanos naturales)
Eliminación química de restos que enmascaran la regularidad (para polímeros)
Separación y purificación de material de carbohidratos (para experimentos de RMN 2D, se recomiendan 10 mg o más)
Preparación de muestras (normalmente en D 2 O)
Adquisición de espectros 1D.
Planificación, adquisición y procesamiento de otros experimentos de RMN (normalmente requiere de 5 a 20 horas)
Asignación e interpretación de espectros (ver figura de ejemplo)
Si un problema estructural no se puede resolver: modificación/degradación química y análisis de productos por RMN
Adquisición de espectros del compuesto nativo (desenmascarado) y su interpretación en base a estructura modificada.
Presentación de resultados
Esquema aproximado de técnicas de RMN (azul) y otras (verde) aplicadas a la elucidación de la estructura de los carbohidratos e información obtenida (en recuadros)
Bases de datos y herramientas de RMN de carbohidratos.
Se han creado múltiples bases de datos de cambios químicos y servicios relacionados para ayudar a la elucidación estructural y al análisis experto de sus espectros de RMN. De ellas, varias herramientas informáticas están dedicadas únicamente a los carbohidratos:
GlycoSCIENCES.de
más de 4.000 espectros de RMN de glicanos de mamíferos [2]
búsqueda de estructura mediante señales de RMN y viceversa
CSDB (base de datos de estructura de carbohidratos [3] [4] ) contiene:
más de 20.000 espectros de RMN (a partir de 2024) de glicanos bacterianos, vegetales, fúngicos y protistálicos,
búsqueda de estructura mediante señales de RMN y viceversa
rutina de simulación de espectros empíricos optimizada para carbohidratos, [5]
estimación estadística del cambio químico basada en el algoritmo HOSE optimizado para carbohidratos, [6] [7]
Generación de estructuras y herramienta de clasificación basada en RMN. [6]
CASPER (evaluación del espectro asistida por computadora de polisacáridos regulares). [8] [9] contiene:
base de datos de cambios químicos,
rutina de simulación de espectros empíricos optimizada para carbohidratos,
interfaz en línea.
herramienta de comparación de estructuras. Se pueden utilizar cambios químicos tanto de protones como de carbono C y H para acceder a información estructural.
Simulación de los observables de RMN.
Predicción comparativa del espectro de 13C NMR de sacarosa utilizando varios métodos. El espectro experimental está en el medio. El espectro superior (negro) se obtuvo mediante rutina empírica. Los espectros más bajos (rojo y verde) se obtuvieron mediante cálculos de química cuántica en PRIRODA y GAUSSIAN respectivamente. Información incluida: nivel teórico utilizado/conjunto de bases/modelo solvente, precisión de la predicción (factor de correlación lineal y desviación cuadrática media), tiempo de cálculo en la computadora personal (azul).
Se han revisado varios enfoques para simular los observables de carbohidratos en RMN. [1] Incluyen:
Enfoques de bases de datos estadísticas universales (ACDLabs, Modgraph, etc.)
Uso de redes neuronales para refinar las predicciones.
Métodos basados en regresión
CARGAR
Esquemas empíricos optimizados en carbohidratos (CSDB/BIOPSEL, CASPER).
Cálculo combinado de geometría molecular/dinámica y simulación/iteración mecánica cuántica de observables de RMN (software PERCH NMR)
Enfoques ONIOM (optimización de diferentes partes de la molécula con diferente precisión)
Cálculos ab initio .
El creciente poder computacional permite el uso de cálculos mecánico-cuánticos exhaustivos en altos niveles teóricos y grandes conjuntos de bases para refinar la geometría molecular de los carbohidratos y la posterior predicción de observables de RMN utilizando GIAO y otros métodos con o sin cuenta del efecto solvente. Entre las combinaciones de nivel teórico y un conjunto de bases reportadas como suficientes para las predicciones de RMN se encuentran B3LYP/6-311G++(2d,2p) y PBE/PBE (ver revisión). Se demostró que, para los sacáridos, los esquemas empíricos optimizados para carbohidratos proporcionan una precisión significativamente mayor (0,0-0,5 ppm por resonancia de 13 C) que los métodos químicos cuánticos (por encima de 2,0 ppm por resonancia) reportados como los mejores para simulaciones de RMN, y funcionan miles de veces más rápido. Sin embargo, estos métodos solo pueden predecir cambios químicos y funcionan mal para partes de moléculas que no son carbohidratos. Como ejemplo representativo, consulte la figura de la derecha.
Ver también
Métodos de espectroscopía de RMN 1D y 2D en estudios estructurales de glicopolímeros naturales (lección) [10]
Bases de datos de carbohidratos en la última década (lección; incluye datos de simulación de RMN) [11]
^ abc Toukach FV; Vicepresidente de Ananikov (2013). "Avances recientes en predicciones computacionales de parámetros de RMN para el esclarecimiento de la estructura de carbohidratos: métodos y limitaciones". Reseñas de la sociedad química . 42 (21): 8376–8415. doi :10.1039/C3CS60073D. PMID 23887200.
^ http://csdb.glicosciences.de
^ "CSDB ruso". csdb.glicoscience.ru .
^ Toukach Ph.V. (2011). "Base de datos 3 de la estructura de los carbohidratos bacterianos: principios y realización". Revista de información y modelado químico . 51 (1): 159-170. doi :10.1021/ci100150d. PMID 21155523.
^ "Ayuda de CSDB: migración de CSDB bacteriano, vegetal y fúngico".
^ ab "Ayuda de CSDB: migración de CSDB bacteriano y de plantas y hongos". csdb.glicoscience.ru .
^ Kapaev RR; Egorova KS; Toukach Ph.V. (2014). "Esquema de generalización de la estructura de carbohidratos para la simulación basada en bases de datos de observables experimentales, como los cambios químicos de RMN". Revista de información y modelado químico . 54 (9): 2594–2611. doi :10.1021/ci500267u. PMID 25020143.
^ "CASPER - Página principal".
^ P.-E. Jansson; R. Stenutz; G. Widmalm (2006). "Determinación de la secuencia de oligosacáridos y polisacáridos regulares mediante espectroscopia de RMN y una novedosa versión basada en Web del programa informático CASPER". Investigación de carbohidratos . 341 (8): 1003–1010. doi :10.1016/j.carres.2006.02.034. PMID 16564037.
^ Toukach, Phyl. "Espectroscopia de RMN 1D y 2D en estudios estructurales de glicopolímeros naturales". Phyl Toukach .
^ Toukach, Phyl. "Phyl Toukach: bases de datos de Glyco". Phyl Toukach .
Medios relacionados con la espectroscopia de resonancia magnética nuclear de carbohidratos en Wikimedia Commons