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Fosfatidilinositol 3,5-bisfosfato

Representación 2D del fosfatidilinositol 3,5-bisfosfato

El fosfatidilinositol 3,5-bisfosfato (PtdIns(3,5)P2) es uno de los siete fosfoinosítidos que se encuentran en las membranas de las células eucariotas. [1] En células quiescentes, los niveles de PtdIns(3,5)P2, típicamente cuantificados por HPLC , son los más bajos entre los fosfoinosítidos constitutivamente presentes. Son aproximadamente de 3 a 5 veces más bajos en comparación con los niveles de PtdIns3P y PtdIns5P ( fosfatidilinositol 5-fosfato ), y más de 100 veces más bajos que los abundantes PtdIns4P ( fosfatidilinositol 4-fosfato ) y PtdIns(4,5)P2 . [2] Se informó por primera vez que PtdIns(3,5)P2 se encontraba en fibroblastos de ratón y en levaduras en ciernes S. cerevisiae en 1997. [3] [4] En S. cerevisiae, los niveles de PtdIns(3,5)P2 aumentan drásticamente durante el choque hiperosmótico. [4] La respuesta al desafío hiperosmótico no se conserva en la mayoría de las células de mamíferos analizadas, excepto en los adipocitos 3T3L1 diferenciados. [4] [5]

Metabolismo

La única vía conocida actualmente para la producción de PtdIns(3,5)P2 es a través de la síntesis catalizada por la fosfoinosítido quinasa PIKfyve . Los experimentos de pulso-persecución en fibroblastos de ratón revelan que PtdIns(3,5)P2 se revierte a PtdIns3P poco después de su síntesis. [3] En células de mamíferos, PtdIns(3,5)P2 se sintetiza a partir de y se convierte en PtdIns3P por un complejo proteico único que contiene dos enzimas con actividades opuestas: la fosfoinosítido quinasa PIKfyve y la PtdIns(3,5)P2 5-fosfatasa que contiene el dominio Sac1, Sac3/ Fig4 . [6] Las dos enzimas no interactúan directamente. Más bien, se unen mediante un regulador asociado de PIKfyve, llamado ArPIKfyve/ VAC14 , que arma un complejo regulador ternario, conocido como el complejo PAS (de las primeras letras de PIKfyve/ArPIKfyve/Sac3). [7] PIKfyve une el complejo PAS a los microdominios endosómicos enriquecidos con Rab5GTP/PtdIns3P a través de su dominio de dedo FYVE que se une selectivamente a PtdIns3P. [8] [9] [10] El papel esencial del complejo PAS en la síntesis y recambio de PtdIns(3,5)P2 está respaldado por datos del silenciamiento de proteínas mediado por ARNi y la expresión heteróloga de los componentes del complejo PAS en varios tipos de células, así como por datos de la eliminación genética de las proteínas del complejo PAS. [5] [6] [11] [12] [13] [14] [15]

Una vía adicional para el recambio de PtdIns(3,5)P2 involucra a la familia de fosfatasas miotubularinas. La miotubularina 1 y MTMR2 desfosforilan la posición 3 de PtdIns(3,5)P2; por lo tanto, el producto de esta hidrólisis es PtdIns5P, en lugar de PtdIns3P. [16] Las proteínas del complejo PAS se conservan evolutivamente con ortólogos encontrados en S. cerevisiae (es decir, proteínas Fab1p, Vac14p y Fig4p) así como en todos los eucariotas con genomas secuenciados. Por lo tanto, se cree que PtdIns(3,5)P2 está presente en todos los eucariotas donde regula funciones celulares similares. Las proteínas Fab1p, Vac14p y Fig4p de levadura también forman un complejo, llamado complejo Fab1. [17] Sin embargo, el complejo Fab1 contiene proteínas adicionales, [18] que podrían añadir una capa adicional de regulación de PtdIns(3,5)P2 en levadura. La composición de los complejos proteicos que regulan los niveles de PtdIns(3,5)P2 en otras especies aún está por aclarar.

Funciones y regulación

PtdIns(3,5)P2 regula las operaciones endosómicas (fisión y fusión) que mantienen la homeostasis de la endomembrana y el correcto funcionamiento de las vías de tráfico que emanan de los endosomas o que los atraviesan. La disminución de los niveles de PtdIns(3,5)P2 tras perturbaciones de PIKfyve celular por expresión heteróloga de mutantes puntuales de PIKfyve enzimáticamente inactivos, [19] silenciamiento medicado con ARNi, [20] inhibición farmacológica [21] y knock out de PIKFYVE [13] provocan la formación de múltiples vacuolas citosólicas, que se hacen más grandes con el tiempo. Es importante destacar que la vacuolización inducida por la disfunción de PIKfyve y el agotamiento de PtdIns(3,5)P2 es reversible y podría ser rescatada selectivamente por microinyección citosólica de PtdIns(3,5)P2, [22] sobreexpresión de PIKfyve [19] o lavado del inhibidor de PIKfyve YM201636. [21] La actividad de la fosfatasa Sac3 en el complejo PAS también juega un papel importante en la regulación de los niveles de PtdIns(3,5)P2 y el mantenimiento de la homeostasis de la endomembrana. Por lo tanto, la vacuolización citoplasmática inducida por el mutante PIKfyveK1831E dominante negativo se suprime tras la coexpresión de un mutante puntual inactivo de la fosfatasa Sac3 junto con ArPIKfyve. [12] Los ensayos de reconstitución in vitro de la fusión de endosomas y la formación/desprendimiento (fisión) de cuerpos multivesiculares (MVB) sugieren un papel positivo de PtdIns(3,5)P2 en la fisión de MVB a partir de endosomas tempranos en maduración y un papel negativo en la fusión de endosomas. [6] [8] PtdIns(3,5)P2 está implicado en el transporte retrógrado dependiente de microtúbulos desde endosomas tempranos/tardíos a la red trans de Golgi. [20] [23]

El tratamiento agudo con insulina aumenta los niveles de PtdIns(3,5)P2 en los adipocitos 3T3L1, tanto en membranas aisladas como en células intactas para promover el efecto de la insulina en la translocación de la superficie celular GLUT4 y el transporte de glucosa. [11] [12] Estas células también muestran un marcado aumento de PtdIns(3,5)P2 tras el choque hiperosmótico. [5] Otros estímulos, incluidas las señales mitogénicas como IL-2 y luz UV en los linfocitos , [24] la activación de la proteína quinasa C por PMA en las plaquetas [25] y la estimulación de las células COS por EGF , [26] también aumentan los niveles de PtdIns(3,5)P2.

PtdIns(3,5)P2 desempeña un papel clave en el crecimiento y el desarrollo, como lo demuestra la letalidad previa a la implantación del modelo de ratón PIKfyve knockout. [13] El hecho de que los ratones PIKfyve heterocigotos sean aparentemente normales y vivan hasta la edad adulta tardía con solo ~60% de los niveles de PtdIns(3,5)P2 de tipo salvaje sugiere que PtdIns(3,5)P2 podría estar normalmente en exceso. [13]

La inactivación de ArPIKfyve/Vac14 o Sac3/Fig4 en ratones produce una disminución del 30-50% en los niveles de PtdIns(3,5)P2 y causa neurodegeneración central masiva y neuropatía periférica similares. [14] [15] Estos estudios sugieren que la reducción de los niveles de PtdIns(3,5)P2, mediante un mecanismo aún por identificar, media la muerte neuronal. Por el contrario, la inactivación de la fosfatasa MTMR2, que también causa neuropatía periférica, se acompaña de una elevación de PtdIns(3,5)P2. [27] Por lo tanto, no está claro si los niveles anormales de PtdIns(3,5)P2 afectan selectivamente a las funciones neuronales periféricas y de qué manera.

Efectores

Los fosfoinosítidos se consideran generalmente como señales ancladas a la membrana que reclutan proteínas efectoras citosólicas específicas. Hasta ahora, se han propuesto varias proteínas como posibles efectores de PtdIns(3,5)P2. Desafortunadamente, las expectativas de que dichos efectores se conservarían evolutivamente y compartirían un motivo de unión a PtdIns(3,5)P2 común de alta afinidad siguen sin cumplirse. Por ejemplo, la eliminación de Atg18p, una proteína involucrada también en la autofagia en S. cerevisiae , causa vacuola agrandada y elevación de 10 veces en PtdIns(3,5)P2. Atg18p se une a PtdIns(3,5)P2 con alta afinidad y especificidad. [28] Sin embargo, a excepción de la autofagia, los ortólogos mamíferos de Atg18p no comparten funciones similares. [29] Otras dos proteínas de levadura (Ent3p y Ent5p) que se encuentran en estructuras prevacuolares y endosómicas son potenciales efectores de PtdIns(3,5)P2 en la clasificación de MVB. Contienen un dominio ENTH de unión a fosfoinosítido y su eliminación causa defectos de clasificación de MVB similares a los informados para la eliminación de Fab1p. [30] Sin embargo, ni Ent3p ni Ent5p poseen especificidad de unión preferencial y de alta afinidad hacia PtdIns(3,5)P2 in vitro. [31] VPS24 de mamíferos (un miembro de la familia de proteínas de cuerpo multivesicular cargadas (CHMP)) es otro supuesto efector de PtdIns(3,5)P2. [32] Lamentablemente, las mediciones de resonancia de plasmón de superficie no respaldan el reconocimiento específico o de alta afinidad de PtdIns(3,5)P2 tanto para VPS24 de mamíferos como de levaduras. [31] El canal catiónico transmembrana humano TRPML1 (cuya inactivación genética causa la enfermedad de almacenamiento lisosomal) ha sido propuesto recientemente como efector de PtdIns(3,5)P2, basándose en ensayos de unión in vitro y su capacidad para rescatar el fenotipo de vacuolización en fibroblastos de ratones knock out ArPIKfyve/Vac14. [33] Pero la eliminación de la proteína ortóloga en levadura no causa agrandamiento de la vacuola, [34] lo que pone en duda la conservación evolutiva de este mecanismo efector. Se necesitan más estudios para validarlos o descubrir efectores PtdIns(3,5)P2 aún desconocidos.

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