El primer walking es una técnica que se utiliza para clonar un gen (por ejemplo, el gen de una enfermedad) a partir de sus marcadores más cercanos conocidos (por ejemplo, un gen conocido). Como resultado, se emplea en esfuerzos de clonación y secuenciación en plantas, hongos y mamíferos con alteraciones menores. Esta técnica, también conocida como "secuenciación dirigida", emplea una serie de reacciones de secuenciación de Sanger para confirmar la secuencia de referencia de un plásmido conocido o un producto de PCR en función de la secuencia de referencia (servicio de confirmación de secuencia) o para descubrir la secuencia desconocida de un plásmido completo o un producto de PCR mediante el diseño de cebadores para secuenciar secciones superpuestas (servicio de descubrimiento de secuencia). [1]
El primer walking es un método para determinar la secuencia de ADN hasta el rango de 1,3–7,0 kb, mientras que el cromosómico walking se utiliza para producir los clones de secuencias ya conocidas del gen. [2] Los fragmentos demasiado largos no se pueden secuenciar en una sola lectura de secuencia utilizando el método de terminación de cadena . Este método funciona dividiendo la secuencia larga en varias secuencias cortas consecutivas. El ADN de interés puede ser un inserto de plásmido , un producto de PCR o un fragmento que representa un espacio al secuenciar un genoma. El término "primer walking" se utiliza cuando el objetivo principal es secuenciar el genoma. El término "chromosome walking" se utiliza en cambio cuando se conoce la secuencia pero no hay un clon de un gen. Por ejemplo, el gen de una enfermedad puede estar ubicado cerca de un marcador específico como un RFLP en la secuencia. [3] El cromosómico walking es una técnica utilizada para clonar un gen (por ejemplo, gen de enfermedad) a partir de sus marcadores conocidos más cercanos (por ejemplo, gen conocido) y, por lo tanto, se utiliza en modificaciones moderadas en proyectos de clonación y secuenciación en plantas, hongos y animales. En otras palabras, se utiliza para encontrar, aislar y clonar una secuencia específica que existe cerca del gen que se va a mapear. Las bibliotecas de fragmentos grandes, principalmente bibliotecas de cromosomas artificiales bacterianos, se utilizan principalmente en proyectos genómicos. Para identificar la colonia deseada y seleccionar un clon en particular, la biblioteca se examina primero con una sonda deseada. Después del examen, el clon se superpone con la sonda y se mapean los fragmentos superpuestos. Estos fragmentos se utilizan luego como una nueva sonda (fragmentos cortos de ADN obtenidos de los extremos 3' o 5' de los clones) para identificar otros clones. Una biblioteca consta aproximadamente de 96 clones y cada clon contiene un inserto diferente. La sonda uno identifica λ1 y λ2 al superponerse a ellos. La sonda dos derivada de clones λ2 se utiliza para identificar λ3, y así sucesivamente. La orientación de los clones se determina mediante el mapeo de restricción de los clones. De este modo, se podrían identificar nuevas regiones cromosómicas presentes en la proximidad de un gen. El recorrido cromosómico requiere mucho tiempo y el aterrizaje cromosómico es el método preferido para la identificación de genes. Este método requiere el descubrimiento de un marcador que esté firmemente relacionado con el locus mutante. [4]
El fragmento se secuencia primero como si fuera un fragmento más corto. La secuenciación se realiza desde cada extremo utilizando iniciadores universales o específicamente diseñados. Esto debería identificar las primeras 1000 bases aproximadamente. Para secuenciar completamente la región de interés, es necesario diseñar y sintetizar nuevos iniciadores (complementarios a las 20 bases finales de la secuencia conocida) para obtener información de secuencia contigua. [5]
El primer walking es un ejemplo de secuenciación dirigida porque el primer está diseñado a partir de una región conocida de ADN para guiar la secuenciación en una dirección específica. A diferencia de la secuenciación dirigida, la secuenciación shotgun de ADN es una estrategia de secuenciación más rápida. [6]
Existe una técnica que se remonta a los "viejos tiempos" de la secuenciación genómica. El método subyacente para la secuenciación es el método de terminación de la cadena de Sanger, que puede tener longitudes de lectura de entre 100 y 1000 pares de bases (según los instrumentos utilizados). Esto significa que hay que descomponer moléculas de ADN más largas, clonarlas y, posteriormente, secuenciarlas. Hay dos métodos posibles. [7]
El primer paso se denomina recorrido cromosómico (o de cebadores) y comienza con la secuenciación del primer fragmento. A continuación, se secuencia el fragmento siguiente (contiguo) de la secuencia utilizando un cebador que es complementario al final de la primera secuencia leída, y así sucesivamente. Esta técnica no requiere mucho ensamblaje, pero sí muchos cebadores y es relativamente lenta. [8]
Para superar este problema se desarrolló el método de secuenciación shotgun, en el que el ADN se divide en diferentes partes (no todas se dividen en el mismo lugar), se clona y se secuencia con cebadores específicos para el vector utilizado para la clonación. Esto da lugar a secuencias superpuestas que luego deben ensamblarse en una sola secuencia en el ordenador. Este método permite la paralelización de la secuenciación (se pueden preparar muchas reacciones de secuenciación al mismo tiempo y ejecutarlas), lo que hace que el proceso sea mucho más rápido y también evita la necesidad de cebadores específicos de la secuencia. El reto es organizar las secuencias en su orden, ya que las superposiciones no son tan claras en este caso. Para resolver este problema, se hace un primer borrador y luego se vuelven a secuenciar las regiones críticas utilizando otras técnicas, como el primer walking. [9]
El proceso general es el siguiente: se utiliza un cebador que coincide con el comienzo del ADN con la secuencia para sintetizar una cadena corta de ADN adyacente a la secuencia desconocida, comenzando con el cebador (ver PCR ). La nueva cadena corta de ADN se secuencia utilizando el método de terminación de cadena. El final de la cadena secuenciada se utiliza como cebador para la siguiente parte de la secuencia larga de ADN, de ahí el término "caminar".
El método se puede utilizar para secuenciar cromosomas enteros (de ahí el "recorrido cromosómico"). [10] El recorrido de cebadores también fue la base para el desarrollo de la secuenciación shotgun , que utiliza cebadores aleatorios en lugar de los elegidos específicamente.
{{cite web}}: |last=tiene nombre genérico ( ayuda ){{cite book}}: CS1 maint: others (link)