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PRIME (técnica de etiquetado)

PRIME ( incorporación de sonda mediada por enzimas ) es una herramienta de investigación de biología molecular desarrollada por Alice Y. Ting y el Laboratorio Ting en el MIT para el etiquetado específico del sitio de proteínas en células vivas con sondas químicas. [1] [2] Las sondas a menudo tienen propiedades biofísicas útiles, como la fluorescencia , y permiten obtener imágenes de proteínas. [1] En última instancia, PRIME permite a los científicos estudiar las funciones de proteínas específicas de interés.

Significado

El etiquetado de proteínas con moléculas fluorescentes permite la visualización de la dinámica de proteínas, la localización y las interacciones proteína-proteína , y por lo tanto sirve como una técnica importante para comprender las funciones y redes de proteínas en células vivas. [3] El etiquetado de proteínas debe tener una alta selectividad hacia la proteína de interés y no debe interferir con las funciones naturales de la proteína. Aunque la codificación genética de proteínas fluorescentes, como la proteína fluorescente verde (GFP), es la técnica más popular debido a su alta especificidad, es probable que las proteínas fluorescentes interfieran con las funciones de la proteína a la que están fusionadas debido a sus grandes tamaños. [3] Existen múltiples herramientas de etiquetado, como HaloTag, SNAP tag y FlAsH, desarrolladas para superar la debilidad del etiquetado de proteínas tradicional con proteínas fluorescentes. Sin embargo, aún tienen deficiencias significativas ya sea por el gran tamaño de una etiqueta o la baja especificidad del proceso de etiquetado. [4] PRIME se ha desarrollado para lograr una alta especificidad de etiquetado comparable a las proteínas fluorescentes con moléculas pequeñas. [4]

Principios

En PRIME, una enzima mutante LplA (ligasa del ácido lipoico de Escherichia coli ) cataliza primero la conjugación del "grupo funcional identificador" y el péptido aceptor LplA (LAP), que está genéticamente fusionado a la proteína de interés. [1] [4] [5] "Grupo funcional identificador" indica una molécula puente que conecta una etiqueta LAP a una sonda fluorescente o fluoróforo . La sonda fluorescente reacciona con el "grupo funcional identificador" conectado a la etiqueta y, en última instancia, marca la proteína de interés. Se pueden utilizar diferentes reacciones químicas para unir la sonda fluorescente a un complejo que consiste en la proteína, la etiqueta LAP y el puente: Reacción de Diels-Alder , [6] y cicloadición de azida-alquino catalizada por cobre asistida por quelación (CuAAC) (consulte Cicloadición de azida-alquino Huisgen ). [7] Otras dos versiones de tecnologías de etiquetado PRIME utilizan proteínas LplA mutantes para incorporar directamente un fluoróforo a la proteína de interés marcada con LAP. [8] [9]

Limitaciones

A pesar de las ventajas de PRIME sobre otros métodos de marcado, PRIME todavía tiene algunas posibles limitaciones. En primer lugar, la etiqueta LAP puede interferir con la función de las proteínas a las que está fusionada. [1] Se recomienda que los experimentadores realicen experimentos de control para asegurarse de que la proteína recombinante marcada funciona correctamente. [1] En segundo lugar, incluso a baja concentración, los productos químicos como la sonda fluorescente pueden ser tóxicos para las células. [1] Los experimentadores también deben obtener el equilibrio adecuado entre la señal máxima de fluorescencia y la mínima alteración de la función celular. [1]

Referencias

  1. ^ abcdefg Uttamapinant C, Sanchez MI, Liu DS, Yao JZ, Ting AY (agosto de 2013). "Etiquetado de proteínas en sitios específicos utilizando PRIME y química de clic asistida por quelación". Nat Protoc . 8 (8): 1620–34. doi :10.1038/nprot.2013.096. PMC  4892701 . PMID  23887180.
  2. ^ Tschesche H, ed. (2011). Métodos en bioquímica de proteínas . Berlín: De Gruyter. ISBN 978-3-11-025236-1.
  3. ^ ab Soh N (19 de febrero de 2008). "Etiquetado químico selectivo de proteínas con pequeñas moléculas fluorescentes basado en la metodología de quelación de metales". Sensores . 8 (2): 1004–1024. Bibcode :2008Senso...8.1004S. doi : 10.3390/s8021004 . PMC 3927527 . PMID  27879749. 
  4. ^ abc Yao JZ, Uttamapinant C, Poloukhtine A, Baskin JM, Codelli JA, Sletten EM, Bertozzi CR, Popik VV, Ting AY (2012). "Orientación de fluoróforos a proteínas celulares mediante ligación de azida mediada por enzimas y cicloadición promovida por cepas". J. Am. Chem. Soc . 134 (8): 3720–8. doi :10.1021/ja208090p. PMC 3306817. PMID 22239252  . 
  5. ^ Demchenko AP, Brouwer AM, ed. (2011). Reporteros de fluorescencia avanzados en química y biología . Heidelberg: Springer. ISBN 978-3-642-18034-7.
  6. ^ Liu DS, Tangpeerachaikul A, Selvaraj R, Taylor MT, Fox JM, Ting AY (2012). "Cicloadición de Diels-Alder para la orientación de fluoróforos a proteínas específicas dentro de células vivas". J. Am. Chem. Soc . 134 (2): 792–5. doi :10.1021/ja209325n. PMC 3381951. PMID  22176354 . 
  7. ^ Uttamapinant C, Tangpeerachaikul A, Grecian S, Clarke S, Singh U, Slade P, Gee KR, Ting AY (2012). "Química de clic rápida y compatible con células con azidas quelantes de cobre para el etiquetado biomolecular". Angew. Chem. Int. Ed. Engl . 51 (24): 5852–6. doi :10.1002/anie.201108181. PMC 3517120. PMID 22555882  . 
  8. ^ Uttamapinant C, White KA, Baruah H, Thompson S, Fernandez-Suarez M, Puthenveetil S, Ting AY (2010). "Una ligasa fluorófora para el etiquetado de proteínas en sitios específicos dentro de células vivas". Proc Natl Acad Sci USA . 107 (24): 10914–9. doi : 10.1073/pnas.0914067107 . PMC 2890758 . PMID  20534555. 
  9. ^ Liu DS, Nivon LG, Richter F, Goldman PJ, Deerinck TJ, Yao JZ, Phipps WS, Ellisman MH, Drennan CL, Baker D, Ting AY (2014). "Diseño computacional de una ligasa de fluoróforo rojo para el etiquetado de proteínas en sitios específicos en células vivas". Proc Natl Acad Sci USA . 111 (43): E4551–9. Bibcode :2014PNAS..111E4551L. doi : 10.1073/pnas.1404736111 . PMC 4217414 . PMID  25313043.