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Reacción en cadena de la polimerasa multiplex

La reacción en cadena de la polimerasa multiplex ( PCR multiplex ) se refiere al uso de la reacción en cadena de la polimerasa para amplificar varias secuencias de ADN diferentes simultáneamente (como si se realizaran muchas reacciones de PCR separadas todas juntas en una reacción). Este proceso amplifica el ADN en muestras utilizando múltiples cebadores y una ADN polimerasa mediada por temperatura en un termociclador . El diseño de cebadores para todos los pares de cebadores debe optimizarse para que todos los pares de cebadores puedan funcionar a la misma temperatura de hibridación durante la PCR.

La PCR multiplex se describió por primera vez en 1988 como un método para detectar deleciones en el gen de la distrofina . [1] También se ha utilizado con el gen de la esteroide sulfatasa . [2] En 2008, la PCR multiplex se utilizó para el análisis de microsatélites y SNP . [3] En 2020, se diseñaron ensayos multiplex de RT-PCR que combinaban múltiples dianas genéticas del Centro para el Control y la Prevención de Enfermedades en una sola reacción para aumentar la accesibilidad y el rendimiento de las pruebas moleculares para el diagnóstico del SARS-CoV-2 . [4]

La PCR multiplex consiste en múltiples conjuntos de cebadores dentro de una única mezcla de PCR para producir amplicones de distintos tamaños que son específicos de diferentes secuencias de ADN. Al dirigirse a múltiples secuencias a la vez, se puede obtener información adicional de una única ejecución de prueba que, de lo contrario, requeriría varias veces más reactivos y más tiempo para realizarla. Las temperaturas de hibridación para cada uno de los conjuntos de cebadores deben optimizarse para que funcionen correctamente dentro de una única reacción, y los tamaños de los amplicones, es decir, la longitud de sus pares de bases, deben ser lo suficientemente diferentes como para formar bandas distintas cuando se visualizan mediante electroforesis en gel . Alternativamente, si los tamaños de los amplicones se superponen, los diferentes amplicones pueden diferenciarse y visualizarse utilizando cebadores que se han teñido con tintes fluorescentes de diferentes colores. Hay kits de multiplexación comerciales para PCR disponibles y utilizados por muchos laboratorios forenses para amplificar muestras de ADN degradado.

Aplicaciones

Algunas de las aplicaciones de la PCR multiplex incluyen:

  1. Identificación de patógenos [5]
  2. Genotipado de SNP de alto rendimiento [6]
  3. Análisis de mutaciones [7]
  4. Análisis de deleción de genes [8]
  5. Cuantificación de plantillas [9]
  6. Análisis de vínculos [10]
  7. Detección de ARN [11]
  8. Estudios forenses [12]
  9. Análisis de la dieta [13]

Referencias

  1. ^ Chamberlain JS, Gibbs RA, Ranier JE, Nguyen PN, Caskey CT (1988). "Detección de deleciones del locus de distrofia muscular de Duchenne mediante amplificación de ADN multiplex". Nucleic Acids Research . 16 (23): 11141–11156. doi :10.1093/nar/16.23.11141. PMC  339001 . PMID  3205741.
  2. ^ Ballabio A, Ranier JE, Chamberlain JS, Zollo M, Caskey CT (1990). "Detección de deleciones del gen de la esteroide sulfatasa (STS) mediante amplificación de ADN multiplex" (PDF) . Human Genetics . 84 (6): 571–573. doi :10.1007/BF00210812. hdl : 2027.42/47626 . PMID  2338343. S2CID  18579745.
  3. ^ Hayden MJ, Nguyen TM, Waterman A, Chalmers KJ (2008). "PCR multiplexada: un nuevo método para la genotipificación de SSR y SNP multiplexada". BMC Genomics . 9 : 80. doi : 10.1186/1471-2164-9-80 . PMC 2275739 . PMID  18282271. 
  4. ^ Perchetti, GA; Nalla, AK; Huang, ML; Jerome, KR ; Greninger, AL (2020). "Multiplexación de conjuntos de cebadores/sondas para la detección del SARS-CoV-2 mediante qRT-PCR". Journal of Clinical Virology . 129 : 104499. doi : 10.1016/j.jcv.2020.104499 . PMC 7278635 . PMID  32535397. 
  5. ^ Järvinen, Anna-Kaarina; Laakso, Sanna; Piiparinen, Pasi; Aittakorpi, Anne; Lindfors, Merja; Huopaniemi, Laura; Piiparinen, Heli; Mäki, Minna (2009). "Identificación rápida de patógenos bacterianos mediante un ensayo basado en PCR y microarrays". Microbiología BMC . 9 : 161. doi : 10.1186/1471-2180-9-161 . PMC 2741468 . PMID  19664269. 
  6. ^ Myakishev, MV (2001). "Genotipado de SNP de alto rendimiento mediante PCR específica de alelos con cebadores marcados con transferencia de energía universal". Genome Research . 11 (1): 163–169. doi :10.1101/gr.157901. PMC 311033 . PMID  11156625. 
  7. ^ Morlan, John; Baker, Joffre; Sinicropi, Dominick (2009). "Detección de mutaciones mediante PCR en tiempo real: un método simple, robusto y altamente selectivo". PLOS ONE . ​​4 (2): e4584. Bibcode :2009PLoSO...4.4584M. doi : 10.1371/journal.pone.0004584 . PMC 2642996 . PMID  19240792. 
  8. ^ Abbs, S; Bobrow, M (1992). "Análisis de PCR cuantitativa para el diagnóstico de portadores de deleción y duplicación en el gen de la distrofina". Journal of Medical Genetics . 29 (3): 191–196. doi :10.1136/jmg.29.3.191. PMC 1015896 . PMID  1552558. 
  9. ^ "Bienvenidos | Centro de análisis forense de ADN" (PDF) .
  10. ^ Reis, Andre (1991). "PCR en el análisis de ligamiento de enfermedades genéticas". PCR Topics . págs. 75–79. doi :10.1007/978-3-642-75924-6_15. ISBN 978-3-540-52934-7.
  11. ^ Miyakawa, Y.; Yoshizawa, H.; Mishiro, S.; Machida, A.; Akahane, Y.; Sugai, Y.; Tanaka, T.; Sugiyama, Y.; Okada, S.; Okamoto, H. (agosto de 1990). "Detección del ARN del virus de la hepatitis C mediante una reacción en cadena de la polimerasa en dos etapas con dos pares de cebadores deducidos de la región no codificante 5'". The Japanese Journal of Experimental Medicine . 60 (4): 215–222. PMID  1963453.
  12. ^ "Evidencia de ADN: conceptos básicos del análisis".
  13. ^ Dunshea, Glenn (2009). "Análisis de la dieta basado en el ADN para cualquier depredador". PLOS ONE . ​​4 (4): e5252. Bibcode :2009PLoSO...4.5252D. doi : 10.1371/journal.pone.0005252 . PMC 2668750 . PMID  19390570.