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La PCR específica de alelo competitivo ( KASP ) es una variante homogénea de genotipado basada en fluorescencia de la reacción en cadena de la polimerasa . Se basa en la extensión de oligos específicos de alelos y la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia para la generación de señales.
Un polimorfismo de un solo nucleótido (SNP) ocurre cuando un solo nucleótido en una secuencia de ADN difiere entre miembros de la misma especie o de un cromosoma pareado . Los SNP funcionan como marcadores moleculares que ayudan a localizar genes asociados con enfermedades y se utilizan para la secuenciación de genotipos. [1]
La genotipificación mediante secuenciación de próxima generación utilizando SNP es costosa, requiere mucho tiempo y faltan algunos datos. Hay muchas otras técnicas SNP que se pueden utilizar según el propósito de la investigación, considerando el rendimiento, el tiempo de respuesta de los datos, la facilidad de uso, el rendimiento (sensibilidad, confiabilidad, reproducibilidad, precisión), la flexibilidad, los requisitos y el costo. Para obtener el mayor rendimiento en estudios a gran escala, es mejor elegir tecnología basada en chips multiplexados . Las tecnologías multiplex generan entre 100 y más de un millón de SNP por ejecución, pero no son económicas de usar para cantidades pequeñas a moderadas de SNP. [2] Para un número menor de SNP, se puede utilizar un ensayo uniplex como KASP.
Hay tres componentes que son críticos para el ensayo KASP: 1) una muestra de ADN purificada, 2) dos cebadores directos específicos de alelo y 3) un cebador inverso común. Se requiere un mínimo de 5 a 10 ng de la muestra de ADN extraída para que el método funcione correctamente. La muestra de ADN se purifica añadiendo una mezcla de productos químicos a la solución tampón. [2] En la primera ronda de PCR, se agrega a la mezcla una mezcla de cebadores KASP que contiene los dos cebadores directos específicos de alelo y el cebador inverso único. La naturaleza específica de los cebadores directos permite que el cebador se una únicamente al SNP de interés, lo que permite que la ADN polimerasa establezca el resto de los nucleótidos complementarios . Durante este tiempo, el cebador inverso común comienza a depositar nucleótidos complementarios en la hebra opuesta de ADN. Con esto finaliza la primera ronda de PCR. [2]
En la segunda ronda de PCR, la cadena complementaria del cebador directo específico del alelo se genera cuando el cebador inverso común se une al amplicón formado en la primera ronda de PCR. Finalmente, continúa el termociclado de la reacción de PCR, iniciando la tercera parte del método KASP. Un cebador marcado con fluorescencia está presente en la mezcla maestra donde se desactiva debido a la hibridación con su parte complementaria que tiene un desactivador al final. El cebador marcado con fluorescencia complementa la secuencia de la cola del cebador directo específico del alelo, lo que permite que se produzca el alargamiento. Esto ocurre varias veces durante los ajustes de termociclado y la señalización fluorescente se vuelve más fuerte a medida que se utilizan más cebadores fluorescentes en el proceso de amplificación. Las etiquetas fluorescentes que normalmente se utilizan son FAM y HEX [3]
El método KASP es más rentable que los métodos multiplex: 15 dólares por ensayo frente a 50 dólares por ensayo. También hay un tiempo de respuesta mucho más corto para recibir los resultados con el método KASP que con otros métodos multiplex: 24 horas frente a una semana. Además, existe una tasa de error de genotipado más baja, del 0,7 al 1,6%. El método KASP es más flexible que otros métodos porque puede usarse cuando hay muchos SNP en unas pocas muestras o cuando hay pocos SNP en muchas muestras. Sin embargo, los métodos multiplex son actualmente las plataformas de mayor rendimiento para el genotipado de SNP. [2]
Esta tecnología tiene muchas aplicaciones en el genotipado de control de calidad (QC), el mapeo de locus de rasgos cuantitativos (QTL), la selección asistida por marcadores (MAS) y la minería de alelos. Por ejemplo, la plataforma KASP se ha utilizado en análisis de control cualitativo del maíz. En el maíz , la homogeneidad es importante a la hora de cultivar los cultivos que el agricultor había seleccionado. Ligeras variaciones en las frecuencias alélicas pueden tener grandes impactos en la calidad del cultivo y pueden ocurrir de diversas maneras, incluso a través de la contaminación cruzada del polen y/o las semillas y en la regeneración de las semillas. El análisis de control de calidad se puede utilizar en los diversos eventos en los que se pueden esperar cambios en la frecuencia alélica, siempre que se tomen muestras de las generaciones parentales y del cultivo F1. Esto garantiza que las frecuencias alélicas no hayan cambiado mucho entre las dos generaciones y garantiza la pureza de la línea en función de los SNP establecidos para el maíz. Para el maíz, se han identificado entre 50 y 100 SNP que pueden usarse para realizar este tipo de análisis. [2]
El análisis de calidad (análisis de control de calidad) se utiliza para mantener la pureza de la línea endogámica. El protocolo de control de calidad del genotipo utiliza entre 50 y 100 SNP para determinar la falta de homogeneidad dentro de una muestra y establecer la identidad genética. El control de calidad se puede utilizar en cualquier momento durante la reproducción.
Si se va a utilizar el control de calidad para mapear la población, se descartan los alelos no parentales y se mantienen los alelos para los cuales más del 90% de los SNP son polimórficos entre los padres.
El mapeo de QTL identifica un subconjunto de marcadores que están significativamente asociados con uno o más QTL que influyen en la expresión del rasgo de interés.
Para mapeo de QTL en maíz: