Espectroscopia de resonancia magnética nuclear de carbohidratos
La espectroscopia de RMN de carbohidratos es la aplicación de la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) al análisis estructural y conformacional de carbohidratos . Este método permite a los científicos dilucidar la estructura de monosacáridos , oligosacáridos , polisacáridos , glicoconjugados y otros derivados de carbohidratos de fuentes sintéticas y naturales. Entre las propiedades estructurales que se pueden determinar mediante RMN se encuentran la estructura primaria (incluida la estereoquímica), la conformación de los sacáridos, la estequiometría de los sustituyentes y la proporción de sacáridos individuales en una mezcla. Los instrumentos de RMN de alto campo modernos utilizados para muestras de carbohidratos, normalmente de 500 MHz o más, pueden ejecutar un conjunto de experimentos 1D, 2D y 3D para determinar la estructura de los compuestos de carbohidratos.
Observables de RMN de carbohidratos
Desplazamiento químico
Los rangos de desplazamiento químico comunes para los núcleos dentro de los residuos de carbohidratos son:
Los desplazamientos químicos típicos de los protones del anillo de carbohidratos en el RMN de 1 H son de 3 a 6 ppm (4,5 a 5,5 ppm para los protones anoméricos).
Los desplazamientos químicos típicos de los carbonos del anillo de carbohidratos en el RMN de 13 C son de 60 a 110 ppm.
En el caso de moléculas simples de mono y oligosacáridos, todas las señales de protones suelen estar separadas entre sí (normalmente en instrumentos de RMN de 500 MHz o mejores) y se pueden asignar utilizando únicamente el espectro de RMN 1D. Sin embargo, las moléculas más grandes muestran una superposición significativa de señales de protones, especialmente en la región no anomérica (3-4 ppm). La RMN de carbono-13 supera esta desventaja mediante un rango más amplio de desplazamientos químicos y técnicas especiales que permiten bloquear el acoplamiento de espín carbono-protón, lo que hace que todas las señales de carbono, singletes altos y estrechos, se puedan distinguir entre sí.
Los rangos típicos de desplazamientos químicos de carbonos de carbohidratos específicos en los monosacáridos no sustituidos son:
Carbonos anoméricos: 90-100 ppm
Carbonos del anillo de azúcar que tienen una función hidroxi: 68-77
Carbonos de azúcar en forma abierta que llevan una función hidroxi: 71-75
Carbonos del anillo de azúcar que tienen una función amino: 50-56
Grupos hidroximetilos exocíclicos: 60-64
Grupos carboxilo exocíclicos: 172-176
Carbonos del anillo de azúcar desoxigenado: 31-40
Un carbono en el cierre del anillo de piranosa: 71-73 (anómeros α), 74-76 (anómeros β)
Un carbono en el cierre del anillo de furanosa: 80-83 (anómeros α), 83-86 (anómeros β)
Constantes de acoplamiento
Las constantes de acoplamiento directo carbono-protón se utilizan para estudiar la configuración anomérica de un azúcar. Las constantes de acoplamiento protón-protón vecinales se utilizan para estudiar la orientación estereoscópica de los protones en relación con los demás protones dentro de un anillo de azúcar, lo que permite identificar un monosacárido. Las constantes de acoplamiento heteronuclear HCOC vecinales se utilizan para estudiar los ángulos de torsión a lo largo del enlace glucosídico entre azúcares o a lo largo de fragmentos exocíclicos, lo que permite revelar una conformación molecular.
Los anillos de azúcar son fragmentos moleculares relativamente rígidos, por lo que los acoplamientos protón-protón vecinales son característicos:
Ecuatorial a axial: 1–4 Hz
De ecuatorial a ecuatorial: 0–2 Hz
Axial a axial no anomérico: 9–11 Hz
Anomérico axial a axial: 7–9 Hz
Hidroximetilo axial a exocíclico: 5 Hz, 2 Hz
Geminal entre protones hidroximetilados: 12 Hz
Efectos nucleares Overhauser (NOE)
Los NOE son sensibles a las distancias interatómicas, lo que permite su uso como sonda conformacional o prueba de la formación de un enlace glicósido. Es una práctica común comparar los NOE protón-protón calculados con los experimentales en oligosacáridos para confirmar un mapa conformacional teórico. El cálculo de los NOE implica una optimización de la geometría molecular.
Otros observables de RMN
Se informó que las relajatividades, las tasas de relajación nuclear, la forma de la línea y otros parámetros eran útiles en los estudios estructurales de los carbohidratos. [1]
Elucidación de la estructura de carbohidratos mediante espectroscopia RMN
Parámetros estructurales de los carbohidratos
La siguiente es una lista de características estructurales que se pueden dilucidar mediante RMN:
Estructura química de cada residuo de carbohidrato en una molécula, incluyendo
Tamaño del esqueleto carbonado y tipo de azúcar (aldosa/cetosa)
tamaño del ciclo (piranosa/furanosa/lineal)
Configuración estereoscópica de todos los carbonos (identificación de monosacáridos)
Configuración estereoscópica del carbono anomérico (α/β)
configuración absoluta (D/L)
Ubicación de funciones amino, carboxi, desoxi y otras
Estructura química de residuos no carbohidratos en la molécula (aminoácidos, ácidos grasos, alcoholes, agliconas orgánicas, etc.)
Posiciones de sustitución en residuos
Secuencia de residuos
Estequiometría de residuos terminales y cadenas laterales
Ubicación de los enlaces diéster de fosfato y sulfato
Grado de polimerización y posicionamiento del marco (para polisacáridos)
Espectroscopia RMN frente a otros métodos
Los métodos de investigación estructural ampliamente conocidos, como la espectrometría de masas y el análisis de rayos X, solo son aplicables de forma limitada a los carbohidratos. [1] Dichos estudios estructurales, como la determinación de secuencias o la identificación de nuevos monosacáridos, se benefician al máximo de la espectroscopia de RMN. La configuración absoluta y el grado de polimerización no siempre se pueden determinar utilizando solo RMN, por lo que el proceso de elucidación estructural puede requerir métodos adicionales. Aunque la composición monomérica se puede determinar mediante RMN, los métodos cromatográficos y espectroscópicos de masas proporcionan esta información a veces más fácilmente. Las otras características estructurales enumeradas anteriormente se pueden determinar únicamente mediante los métodos espectroscópicos de RMN. La limitación de los estudios estructurales de RMN de los carbohidratos es que la elucidación de la estructura difícilmente se puede automatizar y requiere un experto humano para derivar una estructura a partir de los espectros de RMN.
Aplicación de diversas técnicas de RMN a carbohidratos
Los glicanos complejos poseen una multitud de señales superpuestas, especialmente en un espectro de protones. Por lo tanto, resulta ventajoso utilizar experimentos 2D para la asignación de señales. La tabla y las figuras a continuación enumeran las técnicas de RMN más extendidas que se utilizan en los estudios de carbohidratos.
Técnicas de RMN heteronuclear en estudios de carbohidratos y átomos típicos intra-residuos (rojo) e inter-residuos (azul) que se unen entre sí.Técnicas de RMN homonuclear en estudios de carbohidratos y átomos típicos intra-residuos (rojo) e inter-residuos (azul) que se unen entre sí.
Esquema de investigación
La investigación espectroscópica de RMN incluye los siguientes pasos:
Extracción de material de carbohidratos (para glicanos naturales)
Eliminación química de fracciones que enmascaran la regularidad (para polímeros)
Separación y purificación de material de carbohidratos (para experimentos de RMN 2D, se recomiendan 10 mg o más)
Preparación de la muestra (normalmente en D2O )
Adquisición de espectros 1D
Planificación, adquisición y procesamiento de otros experimentos de RMN (normalmente requiere de 5 a 20 horas)
Asignación e interpretación de espectros (ver figura ejemplar)
Si no se pudo resolver un problema estructural: modificación/degradación química y análisis de RMN de los productos
Adquisición de espectros del compuesto nativo (desenmascarado) y su interpretación en función de la estructura modificada
Presentación de resultados
Esquema aproximado de técnicas de RMN (azul) y otras (verdes) aplicadas a la elucidación de la estructura de carbohidratos, e información obtenida (en recuadros)
Bases de datos y herramientas de RMN de carbohidratos
Se han creado múltiples bases de datos de desplazamiento químico y servicios relacionados para ayudar a la elucidación estructural y el análisis experto de sus espectros de RMN. De ellos, varias herramientas informáticas están dedicadas exclusivamente a los carbohidratos:
GlycoSCIENCES.de
Más de 4.000 espectros de RMN de glicanos de mamíferos [2]
Búsqueda de estructura mediante señales de RMN y viceversa.
La CSDB (base de datos de estructura de carbohidratos [3] [4] ) contiene:
Más de 20.000 espectros de RMN (a partir de 2024) de glicanos bacterianos, vegetales, fúngicos y protistas,
Búsqueda de estructura mediante señales de RMN y viceversa.
Rutina de simulación de espectros empíricos optimizada para carbohidratos, [5]
Estimación estadística del desplazamiento químico basada en el algoritmo HOSE optimizado para carbohidratos, [6] [7]
Herramienta de generación de estructuras y clasificación basada en RMN. [6]
CASPER (evaluación del espectro asistida por computadora de polisacáridos regulares). [8] [9] contiene:
base de datos de desplazamiento químico,
Rutina de simulación de espectros empíricos optimizada para carbohidratos,
Interfaz en línea.
Herramienta de comparación de estructuras. Se pueden utilizar los desplazamientos químicos de C y H tanto de protones como de carbono para acceder a información estructural.
Simulación de los observables de RMN
Predicción comparativa del espectro de RMN de 13C de la sacarosa utilizando varios métodos. El espectro experimental se encuentra en el medio. El espectro superior (negro) se obtuvo mediante una rutina empírica. Los espectros inferiores (rojo y verde) se obtuvieron mediante cálculos químicos cuánticos en PRIRODA y GAUSSIAN respectivamente. Información incluida: nivel teórico utilizado/conjunto de bases/modelo de disolvente, precisión de la predicción (factor de correlación lineal y desviación cuadrática media), tiempo de cálculo en computadora personal (azul).
Se han revisado varios enfoques para simular observables de RMN de carbohidratos. [1] Estos incluyen:
Enfoques de bases de datos estadísticas universales (ACDLabs, Modgraph, etc.)
Uso de redes neuronales para refinar las predicciones
Métodos basados en regresión
CARGAR
Esquemas empíricos optimizados en carbohidratos (CSDB/BIOPSEL, CASPER).
Cálculo combinado de geometría de dinámica/mecánica molecular y simulación/iteración cuántico-mecánica de observables de RMN (software de RMN PERCH)
Enfoques ONIOM (optimización de diferentes partes de la molécula con diferente precisión)
Cálculos ab initio .
El aumento de la capacidad computacional permite el uso de cálculos mecánico-cuánticos exhaustivos a niveles teóricos elevados y grandes conjuntos de bases para refinar la geometría molecular de los carbohidratos y la predicción posterior de observables de RMN utilizando GIAO y otros métodos con o sin efecto del solvente. Entre las combinaciones de nivel teórico y un conjunto de bases que se informó como suficiente para las predicciones de RMN se encuentran B3LYP/6-311G++(2d,2p) y PBE/PBE (ver la revisión). Se demostró que, para los sacáridos, los esquemas empíricos optimizados para carbohidratos brindan una precisión significativamente mejor (0,0-0,5 ppm por resonancia de 13 C) que los métodos químicos cuánticos (por encima de 2,0 ppm por resonancia) informados como mejores para las simulaciones de RMN, y funcionan miles de veces más rápido. Sin embargo, estos métodos solo pueden predecir desplazamientos químicos y tienen un rendimiento deficiente para las partes de las moléculas que no son carbohidratos. Como ejemplo representativo, consulte la figura de la derecha.
Véase también
Métodos de espectroscopia RMN 1D y 2D en estudios estructurales de glicopolímeros naturales (lección) [10]
Bases de datos de carbohidratos en la última década (lección; incluye datos de simulación de RMN) [11]
^ abc Toukach FV; Ananikov VP (2013). "Avances recientes en predicciones computacionales de parámetros de RMN para la elucidación de la estructura de carbohidratos: métodos y limitaciones". Chemical Society Reviews . 42 (21): 8376–8415. doi :10.1039/C3CS60073D. PMID 23887200.
^ http://csdb.glicosciences.de
^ "CSDB ruso". csdb.glycoscience.ru .
^ Toukach Ph.V. (2011). "Base de datos de estructura de carbohidratos bacterianos 3: principios y realización". Revista de información y modelado químico . 51 (1): 159–170. doi :10.1021/ci100150d. PMID 21155523.
^ "Ayuda CSDB: Migración desde CSDB de bacterias y plantas y hongos".
^ ab "Ayuda CSDB: migración desde CSDB bacteriano y de plantas y hongos". csdb.glycoscience.ru .
^ Kapaev RR; Egorova KS; Toukach Ph.V. (2014). "Esquema de generalización de la estructura de carbohidratos para la simulación basada en bases de datos de observables experimentales, como desplazamientos químicos de RMN". Journal of Chemical Information and Modeling . 54 (9): 2594–2611. doi :10.1021/ci500267u. PMID 25020143.
^ "CASPER - Página principal".
^ P.-E. Jansson; R. Stenutz; G. Widmalm (2006). "Determinación de secuencia de oligosacáridos y polisacáridos regulares utilizando espectroscopia de RMN y una nueva versión basada en la Web del programa informático CASPER". Investigación de carbohidratos . 341 (8): 1003–1010. doi :10.1016/j.carres.2006.02.034. PMID 16564037.
^ Toukach, Phyl. "Espectroscopia RMN 1D y 2D en estudios estructurales de glicopolímeros naturales". Phyl Toukach .
^ Toukach, Phyl. "Phyl Toukach: bases de datos de Glyco". Phyl Toukach .
Medios relacionados con Espectroscopia de resonancia magnética nuclear de carbohidratos en Wikimedia Commons