Microscopía de contraste de interferencia de fluorescencia.

La microscopía de contraste de interferencia de fluorescencia (FLIC) es una técnica microscópica desarrollada para lograr una resolución z en la escala nanométrica.

FLIC ocurre siempre que hay objetos fluorescentes cerca de una superficie reflectante (por ejemplo, oblea de Si). La interferencia resultante entre la luz directa y la reflejada conduce a una doble modulación sin ² de la intensidad, I, de un objeto fluorescente en función de la distancia, h, sobre la superficie reflectante. Esto permite realizar mediciones de altura nanométrica .

El microscopio FLIC es muy adecuado para medir la topografía de una membrana que contiene sondas fluorescentes, por ejemplo, una bicapa lipídica artificial , una membrana celular viva o la estructura de proteínas marcadas con fluorescencia en una superficie.

Teoría óptica FLIC

Sistema general de dos capas.

La teoría óptica subyacente a FLIC fue desarrollada por Armin Lambacher y Peter Fromherz. Derivaron una relación entre la intensidad de fluorescencia observada y la distancia del fluoróforo a una superficie de silicio reflectante .

La intensidad de fluorescencia observada, es el producto de la probabilidad de excitación por unidad de tiempo, y la probabilidad de medir un fotón emitido por unidad de tiempo . Ambas probabilidades son función de la altura del fluoróforo sobre la superficie del silicio, por lo que la intensidad observada también será función de la altura del fluoróforo. La disposición más sencilla a considerar es un fluoróforo incrustado en dióxido de silicio (índice de refracción ) a una distancia d de una interfaz con el silicio (índice de refracción ). El fluoróforo se excita con luz de longitud de onda y emite luz de longitud de onda . El vector unitario da la orientación del dipolo de transición de excitación del fluoróforo. es proporcional a la proyección al cuadrado del campo eléctrico local , que incluye los efectos de la interferencia , en la dirección del dipolo de transición. El campo eléctrico local, en el fluoróforo, se ve afectado por la interferencia entre la luz incidente directa y la luz reflejada en la superficie del silicio. La interferencia se cuantifica por la diferencia de fase dada por el ángulo de la luz incidente con respecto al plano normal del silicio. No sólo la interferencia modula , sino que la superficie de silicio no refleja perfectamente la luz incidente. Los coeficientes de Fresnel dan el cambio de amplitud entre una onda incidente y una reflejada. Los coeficientes de Fresnel dependen de los ángulos de incidencia y de los índices de refracción de los dos medios y de la dirección de polarización . Los ángulos y se pueden relacionar mediante la Ley de Snell . Las expresiones para los coeficientes de reflexión son: TE se refiere a la componente del campo eléctrico perpendicular al plano de incidencia y TM a la componente paralela (El plano incidente está definido por el plano normal y la dirección de propagación de la luz). En coordenadas cartesianas , el campo eléctrico local es el ángulo de polarización de la luz incidente con respecto al plano de incidencia. La orientación del dipolo de excitación es función de su ángulo con la normal y azimutal con el plano de incidencia. Las dos ecuaciones anteriores para y se pueden combinar para dar la probabilidad de excitar el fluoróforo por unidad de tiempo . Muchos de los parámetros utilizados anteriormente variarían en un experimento normal. En esta descripción teórica se debe incluir la variación de los cinco parámetros siguientes. ${\displaystyle I_{FLIC}}$ ${\displaystyle P_{ex}}$ ${\displaystyle P_{em}}$ ${\displaystyle n_{1}}$ ${\displaystyle n_{0}}$ ${\displaystyle \lambda _{ex}}$ ${\displaystyle \lambda _{em}}$ ${\displaystyle ''e_{ex}''}$ ${\displaystyle P_{ex}}$ ${\displaystyle F_{in}}$
${\displaystyle P_{ex}\propto \mid F_{in}\cdot e_{ex}\mid ^{2}}$
${\displaystyle F_{in}}$ ${\displaystyle \Phi _{in}}$
${\displaystyle \Phi _{in}={\frac {4\pi n_{1}d\cos \theta _{1}^{in}}{\lambda _{ex}}}}$
${\displaystyle \theta _{1}^{in}}$ ${\displaystyle F_{in}}$ ${\displaystyle \theta _{i}}$ ${\displaystyle \theta _{j}}$ ${\displaystyle \theta _{i}}$ ${\displaystyle \theta _{j}}$
${\displaystyle r_{ij}^{TE}={\frac {n_{i}\cos \theta _{i}-n_{j}\cos \theta _{j}}{n_{i}\cos \theta _{i}+n_{j}\cos \theta _{j}}}\quad r_{ij}^{TM}={\frac {n_{j}\cos \theta _{i}-n_{i}\cos \theta _{j}}{n_{j}\cos \theta _{i}+n_{i}\cos \theta _{j}}}}$

${\displaystyle F_{in}=\sin \gamma _{in}\left[{\begin{array}{c}0\\1+r_{10}^{TE}{\textit {e}}^{i\Phi _{in}}\\0\end{array}}\right]+\cos \gamma _{in}\left[{\begin{array}{c}\cos \theta _{1}^{in}(1-r_{10}^{TM}{\textit {e}}^{i\Phi _{in}})\\0\\\sin \theta _{1}^{in}(1+r_{10}^{TM}{\textit {e}}^{i\Phi _{in}})\end{array}}\right]}$
${\displaystyle \gamma _{in}}$ ${\displaystyle \theta _{ex}}$ ${\displaystyle \phi _{ex}}$
${\displaystyle {\textit {e}}_{ex}=\left[{\begin{array}{c}\cos \phi _{ex}\sin \theta _{ex}\\\sin \phi _{ex}\sin \theta _{ex}\\\cos \theta _{ex}\end{array}}\right]}$
${\displaystyle F_{in}}$ ${\displaystyle {\textit {e}}_{ex}}$ ${\displaystyle P_{ex}}$

• La coherencia de la luz de excitación.
• El ángulo de incidencia ( ) de la luz de excitación. ${\displaystyle \theta _{1}^{in}}$
• Ángulo de polarización ( ) de la luz de excitación. ${\displaystyle \gamma _{in}}$
• El ángulo de transición dipolo ( ) del fluoróforo. ${\displaystyle \theta _{ex}}$
• La longitud de onda de la luz de excitación ( ) ${\displaystyle \lambda _{ex}}$

La proyección al cuadrado debe promediarse sobre estas cantidades para dar la probabilidad de excitación . Promediar los primeros 4 parámetros da ${\displaystyle \mid F_{in}\cdot e_{ex}\mid ^{2}}$ ${\displaystyle P_{ex}}$
${\displaystyle <\mid F_{in}\cdot e_{ex}\mid ^{2}>\propto \int \sin \theta _{1}^{in}d\theta _{1}^{in}A_{in}(\theta _{1}^{in})\times \int \sin \theta _{ex}d\theta _{ex}O(\theta _{ex})U_{ex}(\lambda _{in},\theta _{1}^{in}.\theta _{ex})}$ ${\displaystyle U_{ex}=\sin ^{2}\theta _{ex}\mid 1+r_{10}^{TE}{\textit {e}}^{i\Phi _{in}}\mid ^{2}+\sin ^{2}\theta _{ex}\cos ^{2}\theta _{1}^{in}\mid 1-r_{10}^{TM}{\textit {e}}^{i\Phi _{in}}\mid ^{2}+2\cos ^{2}\theta _{ex}\sin ^{2}\theta _{1}^{in}\mid 1+r_{10}^{TM}{\textit {e}}^{i\Phi _{in}}\mid ^{2}}$

Ejemplo de un gráfico de intensidad de FLIC que muestra la intensidad de fluorescencia relativa medida frente a la distancia del fluoróforo desde la superficie reflectante. Es posible que los picos no tengan la misma altura en un gráfico experimental real

No se incluyen los factores de normalización. es una distribución del ángulo de orientación de los dipolos del fluoróforo. El ángulo azimutal y el ángulo de polarización se integran analíticamente, por lo que ya no aparecen en la ecuación anterior. Para finalmente obtener la probabilidad de excitación por unidad de tiempo, la ecuación anterior se integra sobre la extensión de la longitud de onda de excitación, teniendo en cuenta la intensidad y el coeficiente de extinción del fluoróforo . Los pasos para calcular son equivalentes a los anteriores para calcular, excepto que las etiquetas de parámetros em se reemplazan con ex y in se reemplaza con out . La intensidad de fluorescencia resultante medida es proporcional al producto de la probabilidad de excitación y la probabilidad de emisión. ${\displaystyle O(\theta _{ex})}$ ${\displaystyle \phi _{ex}}$ ${\displaystyle \gamma _{in}}$ ${\displaystyle I(\lambda _{ex})}$ ${\displaystyle \epsilon (\lambda _{ex})}$
${\displaystyle P_{ex}\propto \int d\lambda _{ex}I(\lambda _{ex})\epsilon (\lambda _{ex})<\mid F_{in}\cdot e_{ex}\mid ^{2}>}$
${\displaystyle P_{em}}$ ${\displaystyle P_{ex}}$
${\displaystyle P_{em}\propto \int d\lambda _{em}\Phi _{det}(\lambda _{em}){\textit {f}}(\lambda _{em})<\mid F_{in}\cdot e_{ex}\mid ^{2}>}$

${\displaystyle I_{FLIC}\propto P_{ex}P_{em}}$
Es importante señalar que esta teoría determina una relación de proporcionalidad entre la intensidad de fluorescencia medida y la distancia del fluoróforo sobre la superficie reflectante. El hecho de que no sea una relación de igualdad tendrá un efecto significativo en el procedimiento experimental. ${\displaystyle I_{FLIC}}$

Configuración experimental

Normalmente se utiliza una oblea de silicio como superficie reflectante en un experimento FLIC. Luego se hace crecer térmicamente una capa de óxido sobre la oblea de silicio para que actúe como espaciador. Encima del óxido se coloca la muestra marcada con fluorescencia, como una membrana lipídica, una célula o proteínas unidas a una membrana. Una vez construido el sistema de muestra, todo lo que se necesita es un microscopio de epifluorescencia y una cámara CCD para realizar mediciones cuantitativas de intensidad.

Este es un diagrama de un ejemplo de configuración experimental FLIC con silicio, tres capas de óxido y una bicapa lipídica marcada con fluorescencia (las estrellas amarillas representan fluoróforos).

El espesor del dióxido de silicio es muy importante para realizar mediciones FLIC precisas. Como se mencionó anteriormente, el modelo teórico describe la intensidad relativa de fluorescencia medida versus la altura del fluoróforo. La posición del fluoróforo no se puede leer simplemente en una única curva FLIC medida. El procedimiento básico es fabricar la capa de óxido con al menos dos espesores conocidos (la capa se puede hacer con técnicas fotolitográficas y el espesor medido por elipsometría ). Los espesores utilizados dependen de la muestra que se mida. Para una muestra con una altura de fluoróforo en el rango de 10 nm, un espesor de óxido de alrededor de 50 nm sería mejor porque la curva de intensidad FLIC es más pronunciada aquí y produciría el mayor contraste entre las alturas de los fluoróforos. El espesor del óxido por encima de unos pocos cientos de nanómetros podría ser problemático porque la curva comienza a difuminarse por la luz policromática y una variedad de ángulos incidentes. Se compara una relación de intensidades de fluorescencia medidas en diferentes espesores de óxido con la relación prevista para calcular la altura del fluoróforo sobre el óxido ( ). Luego, la ecuación anterior se puede resolver numéricamente para encontrar . Las imperfecciones del experimento, como la reflexión imperfecta, la incidencia anormal de la luz y la luz policromática, tienden a borrar las marcadas curvas de fluorescencia. La dispersión del ángulo de incidencia se puede controlar mediante la apertura numérica (NA). Sin embargo, dependiendo de la apertura numérica utilizada, el experimento producirá una buena resolución lateral (xy) o una buena resolución vertical (z), pero no ambas. Una NA alta (~1,0) proporciona una buena resolución lateral, que es mejor si el objetivo es determinar una topografía de largo alcance. Por otro lado, la NA baja (~0,001) proporciona una medición precisa de la altura z para determinar la altura de una molécula marcada con fluorescencia en un sistema. ${\displaystyle d_{\textit {f}},}$
${\displaystyle {\frac {I_{theory}(d_{1})}{I_{theory}(d_{0})}}={\frac {I_{exp}(d_{1}+d_{\textit {f}})}{I_{exp}(d_{0}+d_{\textit {f}})}}}$
${\displaystyle d_{\textit {f}}}$

Análisis

Ejemplo de datos experimentales recopilados para una muestra marcada con fluorescencia en más de 16 espesores de óxido. Ajustar la curva a los 16 puntos de datos daría la altura de los fluoróforos sobre la superficie del óxido.

El análisis básico implica ajustar los datos de intensidad con el modelo teórico permitiendo que la distancia del fluoróforo sobre la superficie del óxido ( ) sea un parámetro libre. Las curvas FLIC se desplazan hacia la izquierda a medida que aumenta la distancia del fluoróforo sobre el óxido. suele ser el parámetro de interés, pero a menudo se incluyen varios otros parámetros gratuitos para optimizar el ajuste. Normalmente se incluyen un factor de amplitud (a) y un término aditivo constante para el fondo (b). El factor de amplitud escala la intensidad relativa del modelo y el fondo constante desplaza la curva hacia arriba o hacia abajo para tener en cuenta la fluorescencia proveniente de áreas fuera de foco, como la parte superior de una celda. Ocasionalmente se permite que la apertura numérica (NA) del microscopio sea un parámetro libre en la adaptación. Los demás parámetros que entran en la teoría óptica, como los distintos índices de refracción, los espesores de las capas y las longitudes de onda de la luz, se suponen constantes con cierta incertidumbre. Un chip FLIC se podrá realizar con terrazas de óxido de 9 o 16 alturas diferentes dispuestas en bloques. Después de capturar una imagen de fluorescencia, cada bloque de 9 o 16 terrazas produce una curva FLIC separada que define un valor único . El promedio se encuentra compilando todos los valores en un histograma. El error estadístico en el cálculo proviene de dos fuentes: el error en el ajuste de la teoría óptica a los datos y la incertidumbre en el espesor de la capa de óxido. El error sistemático proviene de tres fuentes: la medición del espesor del óxido (generalmente mediante elipsómetro), la medición de la intensidad de fluorescencia con el CCD y la incertidumbre en los parámetros utilizados en la teoría óptica. Se ha estimado que el error sistemático es . ${\displaystyle d_{\textit {f}}}$ ${\displaystyle d_{\textit {f}}}$ ${\displaystyle d_{\textit {f}}}$ ${\displaystyle d_{\textit {f}}}$ ${\displaystyle d_{\textit {f}}}$
${\displaystyle d_{\textit {f}}}$ ${\displaystyle \sim 1nm}$

Referencias

• Ajo-Franklin, Caroline M.; Yoshina-Ishii, Chiaki; Boxeador, Steven G. (2005). "Sondeo de la estructura de membranas soportadas y oligonucleótidos anclados mediante microscopía de contraste de interferencia de fluorescencia". Langmuir . 21 (11). Sociedad Química Estadounidense (ACS): 4976–4983. doi :10.1021/la0468388. ISSN  0743-7463. PMID  15896039.
• Braun, D.; Fromherz, P. (1 de octubre de 1997). "Microscopía de contraste de interferencia de fluorescencia de la adhesión celular sobre silicio oxidado". Física aplicada A: ciencia y procesamiento de materiales . 65 (4-5). Springer Science y Business Media LLC: 341–348. Código bibliográfico : 1997ApPhA..65..341B. doi :10.1007/s003390050589. ISSN  0947-8396. S2CID  16478620.
• Braun, Dieter; Fromherz, Peter (7 de diciembre de 1998). "Interferometría de fluorescencia de la adhesión de células neuronales sobre silicio microestructurado". Cartas de revisión física . 81 (23). Sociedad Estadounidense de Física (APS): 5241–5244. Código bibliográfico : 1998PhRvL..81.5241B. doi :10.1103/physrevlett.81.5241. ISSN  0031-9007.
• Grúa, Jonathan M.; Kiessling, Volker; Tamm, Lucas K. (2005). "Medición de la asimetría lipídica en bicapas soportadas planas mediante microscopía de contraste de interferencia de fluorescencia". Langmuir . 21 (4). Sociedad Química Estadounidense (ACS): 1377–1388. doi :10.1021/la047654w. ISSN  0743-7463. PMID  15697284.
• Kaizuka, Yoshihisa; Groves, Jay T. (20 de marzo de 2006). "Amortiguación hidrodinámica de las fluctuaciones térmicas de las membranas cerca de superficies obtenidas mediante microscopía de interferencia de fluorescencia". Cartas de revisión física . 96 (11). Sociedad Estadounidense de Física (APS): 118101. Bibcode : 2006PhRvL..96k8101K. doi : 10.1103/physrevlett.96.118101. ISSN  0031-9007. PMID  16605875.
• Kiessling, Volker; Tamm, Lucas K. (2003). "Medición de distancias en bicapas soportadas mediante microscopía de contraste de interferencia de fluorescencia: soportes poliméricos y proteínas SNARE". Revista Biofísica . 84 (1). Elsevier BV: 408–418. Código Bib : 2003BpJ....84..408K. doi : 10.1016/s0006-3495(03)74861-9 . ISSN  0006-3495. PMC  1302622 . PMID  12524294.
• Lambacher, Armin; Fromherz, Peter (1996). "Microscopía de contraste de interferencia de fluorescencia sobre silicio oxidado utilizando una capa de tinte monomolecular". Física aplicada A: ciencia y procesamiento de materiales . 63 (3). Springer Science y Business Media LLC: 207–216. Código bibliográfico : 1996ApPhA..63..207L. doi :10.1007/bf01567871. ISSN  0947-8396. S2CID  16072847.
• Lambacher, Armin; Fromherz, Peter (1 de junio de 2002). "Luminiscencia de moléculas de tinte sobre silicio oxidado y microscopía de contraste de interferencia de fluorescencia de biomembranas". Revista de la Sociedad Óptica de América B. 19 (6). La Sociedad Óptica: 1435-1453. Código Bib : 2002JOSAB..19.1435L. doi :10.1364/josab.19.001435. ISSN  0740-3224.
• Parthasarathy, Raghuveer ; Arboledas, Jay T. (2004). "Técnicas ópticas para la obtención de imágenes de topografía de membranas". Bioquímica y Biofísica Celular . 41 (3). Springer Science y Business Media LLC: 391–414. doi :10.1385/cbb:41:3:391. ISSN  1085-9195. PMID  15509889. S2CID  11674192.