El inmunoensayo espectrométrico de masas ( MSIA ) es un método rápido que se utiliza para detectar o cuantificar antígenos o analitos de anticuerpos. [1] Este método utiliza un aislamiento de afinidad de analito (ya sea a través de antígenos o anticuerpos) para extraer moléculas específicas y estándares internos del fluido biológico en preparación para la espectrometría de masas de desorción por láser asistida por matriz-ionización-tiempo de vuelo ( MALDI-TOF-MS ). [2] [3] [4] Este método permite un análisis "de arriba hacia abajo" y "de abajo hacia arriba". Este método sensible permite un proceso nuevo y mejorado para detectar múltiples antígenos y anticuerpos en un solo ensayo. [1] Este ensayo también es capaz de distinguir formas de masa desplazada de la misma molécula a través de un pananticuerpo, así como distinguir mutaciones puntuales en proteínas. [4] [5] Cada forma específica se detecta de forma única en función de su masa molecular característica. MSIA tiene doble especificidad debido a la reacción anticuerpo-antígeno acoplada con la potencia de un espectrómetro de masas.
Existen otras técnicas de inmunoensayo que se han utilizado anteriormente, como el radioinmunoensayo (RIA) y el enzimoinmunoensayo (EIA y ELISA). Estas técnicas son extremadamente sensibles, sin embargo, tienen muchas limitaciones. Por ejemplo, la cuantificación para ELISA y EIA requiere varias horas porque la unión debe alcanzar el equilibrio. [1] La desventaja del RIA es que necesita partículas radiactivas que se sabe universalmente que son carcinógenas.
La creación del MSIA respondió a la necesidad de determinar la presencia de uno o más antígenos en una muestra así como la cuantificación de dichas especies.
Este ensayo fue patentado en 2006 por Randall Nelson, Peter Williams y Jennifer Reeve Krone. [1] La idea surgió por primera vez con el desarrollo de ELISA y RIA. [6] Un método patentado anterior sugería marcar antígenos o anticuerpos con isótopos estables o elementos radiactivos de larga duración. [7] Pero las limitaciones de ambos métodos exigían mejores métodos de detección de una proteína o proteínas. La invención combina la unión antígeno-anticuerpo con un espectrómetro de masas que ayuda a identificar cualitativamente y cuantificar analitos respectivamente.
Un experimento inicial de MSIA se realizó en una muestra de sangre humana contaminada con veneno para la miotoxina del antígeno. El experimento tuvo éxito porque el espectro de masas resultante del análisis mostró una respuesta clara para la miotoxina en el peso molecular correspondiente a 4822 Da (a). [1] La relación m/z en 5242 Da (b) es el peso molecular de la variante modificada H-myotoxina, utilizada como especie de referencia interna. La figura del espectro de masas se muestra a continuación.
En la figura de la derecha se muestra una ilustración del procedimiento MSIA. Los analitos en una muestra biológica líquida se recogen de la solución utilizando una punta MSIA (también conocida como microcolumnas MSIA [8] ) que contiene una frita de afinidad derivatizada. Las muestras biológicas contienen varias proteínas que abarcan un amplio rango dinámico, por lo que se necesita purificación para minimizar la matriz compleja y maximizar la sensibilidad de la espectrometría de masas. [9] La punta MSIA sirve como un lugar para purificar estas muestras inmovilizando el analito con alta selectividad y especificidad. Los analitos se unen a la frita en función de sus afinidades y todas las demás moléculas no específicas se eliminan. A continuación, los objetivos específicos se eluyen en una placa de objetivos de espectrómetro de masas con una matriz MALDI. Sin embargo, las proteínas se pueden digerir antes del análisis de ms. Posteriormente se realiza un MALDI-TOF-MS y se detectan los analitos específicos en función de sus valores m/z. Este método es cualitativo, pero la adición de variantes de masa desplazada del analito para su uso como estándar interno hace que este método sea útil para el análisis cuantitativo. [5]
Las puntas de pipeta, que se han denominado puntas MSIA o puntas de pipeta de afinidad, desempeñan un papel fundamental en el proceso de detección de analitos en muestras biológicas. Las puntas MSIA suelen contener un soporte sólido poroso que tiene antígenos o anticuerpos derivatizados unidos de forma covalente. Los distintos analitos tienen una afinidad diferente por las puntas, por lo que es necesario derivatizar las puntas MSIA en función del analito de interés. El uso principal de estas puntas es hacer fluir las muestras y la afinidad de los analitos por el antígeno o anticuerpo unido permite la captura del analito. Los compuestos no unidos específicamente se eliminan de las puntas MSIA.
El proceso se puede simplificar en seis sencillos pasos que Thermo denomina "flujo de trabajo".
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El MSIA es un método que se puede utilizar como ensayo para una variedad de moléculas diferentes, como proteínas, hormonas, fármacos, toxinas y varios patógenos que se encuentran en fluidos biológicos (plasma humano y animal, saliva, orina, lágrimas, etc.). [1] [10] El MSIA también se ha aplicado a muestras clínicas y se ha demostrado que es un ensayo único para proteínas clínicamente relevantes. [11] El ensayo exitoso de toxinas, fármacos y otros patógenos es importante para el medio ambiente y el cuerpo humano. El MSIA se puede utilizar para una variedad de aplicaciones biomédicas y ambientales.
Una aplicación importante de la inmunoensayo espectrométrico de masas es que puede utilizarse como un método rápido, sensible y preciso para detectar apolipoproteínas y mutaciones de las mismas. Las apolipoproteínas representan un grupo de proteínas con muchas funciones, como el transporte y la eliminación, así como la activación enzimática. [4] Estudios recientes han afirmado que las mutaciones en las apolipoproteínas dan lugar a, o ayudan a la progresión de varias enfermedades asociadas, entre las que se incluyen la amiloidosis, la miocardiopatía amiloide, la enfermedad de Alzheimer, la hipertrigliceridemia, el colesterol bajo, la hiperlipidemia y la aterosclerosis, por nombrar algunas. Nelson y sus colegas realizaron un estudio utilizando MSIA para caracterizar y aislar especies de apolipoproteínas. [ cita requerida ]
El uso de un inmunoensayo espectrométrico de masas tiene muchas ventajas. La más importante es que el ensayo es extremadamente rápido y los datos son reproducibles y automatizados. Son sensibles, precisos y permiten una cuantificación absoluta. Los analitos se pueden detectar hasta límites de detección bajos (tan bajos como picomolar) y el ensayo cubre un amplio rango dinámico [9] .