En bioquímica y genética molecular , un sitio AP ( sitio apurínico/apirimidínico ), también conocido como sitio abásico , es una ubicación en el ADN (también en el ARN , pero mucho menos probable) que no tiene una base purínica ni pirimidina , ya sea de forma espontánea o debido al daño del ADN . Se ha estimado que en condiciones fisiológicas se pueden generar diariamente en una célula 10.000 sitios apurínicos y 500 apirimidínicos. [1] [2]
Los sitios AP pueden formarse por despurinación espontánea , pero también ocurren como intermediarios en la reparación por escisión de la base . [3] En este proceso, una ADN glicosilasa reconoce una base dañada y escinde el enlace N-glucosídico para liberar la base, dejando un sitio AP. Existe una variedad de glicosilasas que reconocen diferentes tipos de daño, incluidas las bases oxidadas o metiladas, o el uracilo en el ADN. El sitio AP puede luego ser escindido por una endonucleasa AP , dejando extremos 3'-hidroxilo y desoxirribosa-5-fosfato (ver estructura del ADN ). De manera alternativa, las glicosilasa-liasas bifuncionales pueden escindir el sitio AP, dejando un fosfato 5' adyacente a un aldehído α,β-insaturado 3'. Ambos mecanismos forman una rotura de una sola hebra, que luego se repara mediante reparación por escisión de la base con parche corto o largo. [4]
Si no se reparan, los sitios AP pueden provocar mutaciones durante la replicación semiconservadora . Pueden provocar un bloqueo de la bifurcación de replicación y son evitados por la síntesis de translesión . En E. coli , la adenina se inserta preferentemente frente a los sitios AP, lo que se conoce como "regla A". La situación es más compleja en los eucariotas superiores, donde diferentes nucleótidos muestran preferencia según el organismo y las condiciones experimentales. [3]
Los sitios AP se forman cuando la desoxirribosa se escinde de su base nitrogenada , rompiendo el enlace glicosídico entre los dos. Esto puede ocurrir de forma espontánea, como resultado de la actividad química, la radiación o la actividad enzimática. Los enlaces glicosídicos del ADN se pueden romper mediante hidrólisis catalizada por ácido . Las bases purínicas pueden expulsarse en condiciones débilmente ácidas, mientras que las pirimidinas requieren una acidez más fuerte para poder escindirse. Las purinas pueden incluso eliminarse a pH neutro , si la temperatura aumenta lo suficiente. La formación del sitio AP también puede ser causada por diversos químicos modificadores de bases. La alquilación , desaminación y oxidación de bases individuales pueden conducir al debilitamiento del enlace glicosilo, por lo que la exposición a agentes que causan esas modificaciones puede fomentar la formación del sitio AP. [2]
La radiación ionizante también puede provocar la formación de sitios AP. Los ambientes irradiados contienen radicales que pueden contribuir a los sitios AP de múltiples maneras. Los radicales hidroxilo pueden atacar los enlaces glicosídicos, creando directamente un sitio AP, o hacer que el enlace glicosilo sea menos favorable al unirse a la base o al anillo de desoxirribosa. [2]
Las enzimas, concretamente las ADN glicosilasas, también suelen crear sitios AP, como parte de la vía de reparación por escisión de bases. Se estima que en una célula de mamífero determinada se forman entre 5.000 y 10.000 sitios apurínicos por día. Los sitios apirimidínicos se forman a un ritmo aproximadamente 20 veces más lento, con estimaciones de alrededor de 500 eventos de formación por día, por célula. A tasas tan altas, es fundamental que las células cuenten con un aparato de reparación robusto para prevenir la mutación.
Los sitios AP son extremadamente reactivos. Fluctúan entre un anillo de furanosa y una conformación de aldehído libre y alcohol libre de cadena abierta . La exposición a un nucleófilo puede provocar una reacción de eliminación β, en la que se rompe el enlace fosfoéster 3' , provocando una rotura monocatenaria. Esta reacción puede ser catalizada por AP liasa . [2] En presencia de exceso de reactivo, puede producirse una eliminación adicional en el lado 5'. El aldehído libre también puede reaccionar con aldehídos nucleofílicos que contienen aminas. Estas reacciones pueden promover aún más la escisión del enlace fosfoéster. Los aldehídos que contienen grupos O-HN2 pueden servir para estabilizar el sitio abásico reaccionando con el grupo aldehído. Esta interacción no rompe el enlace fosfoéster.
Los sitios AP en células vivas pueden causar diversas y graves consecuencias, incluida la muerte celular. Las roturas monocatenarias que se producen debido a la eliminación β requieren reparación mediante ADN ligasa para evitar la mutación. Cuando la ADN polimerasa encuentra un sitio abásico, la replicación del ADN generalmente se bloquea, lo que a su vez puede conducir a una rotura monocatenaria o bicatenaria en la hélice del ADN. [4] En E. coli , cuando la enzima logra evitar el sitio abásico, se incorpora preferentemente una adenina a la nueva cadena. [2] [3] Si los sitios AP en el ADN no se reparan, la replicación del ADN no puede realizarse normalmente y pueden producirse mutaciones significativas. [4] Si las mutaciones son simplemente polimorfismos de un solo nucleótido , entonces la célula puede potencialmente no verse afectada. Sin embargo, si se producen mutaciones más graves, la función celular puede verse gravemente afectada, el crecimiento y la división pueden verse afectados o la célula simplemente puede morir.
Los sitios AP son una característica importante de la vía de reparación por escisión de la base. Las ADN glicosilasas primero crean sitios abásicos reconociendo y eliminando bases modificadas. Existen muchas variantes de glicosilasa para abordar las múltiples formas en que se puede dañar una base. Las circunstancias más comunes son la alquilación de bases, la oxidación y la presencia de un uracilo en la cadena de ADN. [4] Una vez que se ha creado con éxito un sitio AP, una endonucleasa AP cataliza la rotura de un enlace fosfoéster, creando una mella en la columna vertebral de la hélice. [4] La rotura puede ser 3' o 5' del sitio, dependiendo de la variante de la enzima. Las enzimas de procesamiento final luego preparan el sitio para la ligadura de mella, que se realiza mediante la ADN polimerasa. [4] La base insertada en la muesca está determinada por la base correspondiente en la hebra opuesta. Luego, la mella se sella con ADN ligasa.
La actividad de la endonucleasa AP en la reparación de sitios AP en la corteza frontal/parietal, cerebelo , tronco encefálico , mesencéfalo e hipotálamo disminuye con la edad en ratas con una dieta ad libitum . [5] En comparación, en ratas con restricción calórica , la actividad de la endonucleasa AP en estas regiones del cerebro sigue siendo mayor con la edad. [5] Estos hallazgos sugieren que la reparación elevada del sitio AP en animales con restricción calórica puede retrasar el proceso de envejecimiento.