Un ensayo de hibridación comprende cualquier forma de hibridación cuantificable , es decir, el apareamiento cuantitativo de dos cadenas complementarias de ácidos nucleicos , conocido como hibridación de ácidos nucleicos . [1]
En el contexto de la bioquímica y el desarrollo de fármacos, un ensayo de hibridación es un tipo de ensayo de unión de ligandos (LBA) que se utiliza para cuantificar los ácidos nucleicos en matrices biológicas. Los ensayos de hibridación pueden realizarse en solución o en un soporte sólido, como placas de 96 pocillos o perlas marcadas.
Los ensayos de hibridación implican sondas de ácidos nucleicos marcadas para identificar moléculas de ADN o ARN relacionadas (es decir, con un grado significativamente alto de similitud de secuencia) dentro de una mezcla compleja de moléculas de ácidos nucleicos no marcadas . La terapia antisentido , el ARNi y otros productos bioterapéuticos basados en oligonucleótidos y ácidos nucleicos se pueden cuantificar con ensayos de hibridación.
La señalización de los métodos de hibridación se puede realizar utilizando sondas de oligonucleótidos modificadas en síntesis con haptenos y ligandos de moléculas pequeñas que actúan de forma homóloga a los anticuerpos de captura y detección. Al igual que con el ELISA tradicional , se pueden utilizar conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP) o fosfatasa alcalina (AP) como anticuerpos secundarios.
En el formato de ensayo ELISA de hibridación sándwich , el ligando de antígeno y los anticuerpos en ELISA se reemplazan con un analito de ácido nucleico, sondas de captura y detección de oligonucleótidos complementarios. [2]
En general, en el caso de la hibridación de ácidos nucleicos, la concentración de sal monovalente y la temperatura se controlan para garantizar la rigurosidad de la hibridación y el lavado, a diferencia de un ELISA tradicional, donde la concentración de sal suele ser fija para los pasos de unión y lavado (es decir, PBS o TBS). Por lo tanto, la concentración óptima de sal en los ensayos de hibridación varía en función de la longitud y la composición de bases del analito y de las sondas de captura y detección.
El ensayo de hibridación competitiva [3] es similar a un inmunoensayo competitivo tradicional . Al igual que otros ensayos de hibridación, se basa en la complementariedad, donde la sonda de captura compite entre el analito y el trazador, un oligonucleótido marcado análogo al analito.
En el ensayo de hibridación-ligación [4] [5] , una sonda de plantilla reemplaza a la sonda de captura en el ensayo sándwich para la inmovilización al soporte sólido. La sonda de plantilla es totalmente complementaria al analito oligonucleótido y está destinada a servir como sustrato para la ligación mediada por la ADN ligasa T4 . La sonda de plantilla tiene además un tramo adicional complementario a una sonda de ligación, de modo que la sonda de ligación se ligará al extremo 3' del analito. Aunque genérica, la sonda de ligación es similar a una sonda de detección en el sentido de que está marcada con, por ejemplo, digoxigenina para la señalización descendente. Un lavado estricto, con poca o ninguna sal, eliminará los productos no ligados.
La ligadura del analito a la sonda de ligadura hace que el método sea específico para el extremo 3' del analito, siendo la ligadura por la ADN ligasa T4 mucho menos eficiente sobre un bucle de protuberancia, lo que sucedería para una versión N-1 del metabolito 3' del analito, por ejemplo. La especificidad del ensayo de hibridación-ligadura para la ligadura en el extremo 3' es particularmente relevante porque las nucleasas predominantes en la sangre son exonucleasas 3' a 5' .
Una limitación del método es que requiere un hidroxilo libre en el extremo 3', que puede no estar disponible cuando las fracciones de destino están unidas al extremo 3', por ejemplo. Además, las químicas de ácidos nucleicos más exóticas con fármacos oligonucleótidos pueden afectar la actividad de la ligasa, lo que debe determinarse caso por caso.
El ensayo de hibridación por ligadura dual (DLA) [6] extiende la especificidad del ensayo de hibridación-ligadura a un método específico para el compuesto original. A pesar de la solidez, la sensibilidad y la especificidad añadida del ensayo de hibridación-ligadura para el extremo 3' del analito oligonucleotídico, el ensayo de hibridación-ligadura no es específico para el extremo 5' del analito.
El DLA está destinado a cuantificar únicamente el compuesto oligonucleótido original de longitud completa, con los extremos 5' y 3' intactos. Las sondas DLA se ligan en los extremos 5' y 3' del analito mediante la acción conjunta de la ADN ligasa T4 y la polinucleótido quinasa T4 . La quinasa fosforila el extremo 5' del analito y la ligasa unirá la sonda de captura al analito y a la sonda de detección. Las sondas de captura y detección en el DLA pueden, por lo tanto, denominarse sondas de ligadura. En cuanto al ensayo de hibridación-ligadura, el DLA es específico para el compuesto original porque la eficiencia de la ligadura sobre un bucle de protuberancia es baja y, por lo tanto, el DLA detecta el analito de longitud completa con los extremos 5' y 3' intactos. El DLA también se puede utilizar para la determinación de metabolitos individuales en matrices biológicas.
Las limitaciones del ensayo de hibridación-ligación también se aplican al ensayo de ligación dual, en el que el extremo 5' además del extremo 3' requiere tener un hidroxilo libre (o un grupo fosfato). Además, las ligasas de ADN T4 son incompatibles con la ligación de moléculas de ARN como donante (es decir, ARN en el extremo 5' de la ligación). Por lo tanto, los antisentidos de segunda generación que comprenden ARN 2'-O-metilo, 2'-O-metoxietilo o ácidos nucleicos bloqueados pueden no ser compatibles con el ensayo de ligación dual.
El ensayo de hibridación de nucleasas, [7] [8] también llamado ensayo de corte de nucleasa S1 , es un ensayo de protección de nucleasas basado en hibridación ELISA. El ensayo utiliza la nucleasa S1 , que degrada el ADN y el ARN monocatenarios en oligonucleótidos o mononucleótidos, dejando intactos el ADN y el ARN bicatenarios.
En el ensayo de hibridación de nucleasas, el oligonucleótido analito se captura en el soporte sólido, como una placa de 96 pocillos, mediante una sonda de corte totalmente complementaria. Después del procesamiento enzimático por la nucleasa S1, la sonda de corte libre y la sonda de corte hibridada con metabolitos, es decir, los meros cortos del analito, se degradan, lo que permite que la señal se genere solo a partir del dúplex sonda de corte-analito de longitud completa.
El ensayo es muy tolerante a diversas químicas, como lo ejemplifica el desarrollo de un ensayo de nucleasa para oligonucleótidos de morfolino . [9]
Esta configuración de ensayo puede carecer de solidez y no es adecuada para la validación siguiendo las pautas de la FDA para la validación de métodos bioanalíticos. Esto se demuestra por la ausencia de métodos publicados que hayan sido validados según los estándares delineados por la FDA para métodos bioanalíticos.
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