Imágenes de fluctuación óptica de súper resolución

La obtención de imágenes de fluctuación óptica de súper resolución ( SOFI ) es un método de posprocesamiento para el cálculo de imágenes de súper resolución a partir de series temporales de imágenes registradas que se basa en las correlaciones temporales de emisores fluorescentes que fluctúan independientemente.

SOFI ha sido desarrollado para la súper resolución de muestras biológicas que están marcadas con emisores fluorescentes que fluctúan independientemente (colorantes orgánicos, proteínas fluorescentes ). En comparación con otras técnicas de microscopía de súper resolución como STORM o PALM que se basan en la localización de una sola molécula y por lo tanto solo permiten una molécula activa por área limitada por difracción (DLA) y punto de tiempo, ^{[1] [2]} SOFI no necesita una fotoconmutación controlada y/o fotoactivación así como tiempos de imagen largos. ^{[3] [4]} Sin embargo, todavía requiere fluoróforos que estén ciclando a través de dos estados distinguibles, ya sea estados reales encendido/apagado o estados con diferentes intensidades de fluorescencia. En términos matemáticos, la obtención de imágenes SOFI se basa en el cálculo de cumulantes , para lo cual existen dos formas distinguibles. Por un lado, una imagen se puede calcular a través de autocumulantes ^[3] que por definición solo se basan en la información de cada píxel en sí, y por otro lado, un método mejorado utiliza la información de diferentes píxeles a través del cálculo de cumulantes cruzados. ^[5] Ambos métodos pueden aumentar significativamente la resolución de la imagen final, aunque el cálculo del cumulante tiene sus limitaciones. En realidad, SOFI es capaz de aumentar la resolución en las tres dimensiones. ^[3]

Principio

Principio del cálculo autocumulante de SOFI (A) Representación esquemática de una cuadrícula de píxeles CCD que contiene varias señales de emisor (B) Recorte de dos fluoróforos con sus señales convolucionadas con la PSF del sistema, registradas en una pila de imágenes (C) Las señales en cada píxel se evalúan mediante el cálculo cumulante (un proceso que puede entenderse en términos de correlación e integración)

Al igual que otros métodos de superresolución, SOFI se basa en la grabación de una serie temporal de imágenes en una cámara CCD o CMOS. A diferencia de otros métodos, la serie temporal grabada puede ser sustancialmente más corta, ya que no se requiere una localización precisa de los emisores y, por lo tanto, se permite una mayor cantidad de fluoróforos activados por área limitada por difracción. Los valores de píxel de una imagen SOFI de orden n se calculan a partir de los valores de la serie temporal de píxeles en forma de un cumulante de orden n , mientras que el valor final asignado a un píxel puede imaginarse como la integral sobre una función de correlación. Las intensidades de los valores de píxel finalmente asignados son una medida del brillo y la correlación de la señal de fluorescencia. Matemáticamente, el cumulante de orden n está relacionado con la función de correlación de orden n , pero presenta algunas ventajas en lo que respecta a la resolución resultante de la imagen. Dado que en SOFI se permiten varios emisores por DLA, el recuento de fotones en cada píxel resulta de la superposición de las señales de todos los emisores cercanos activados. El cálculo de cumulantes ahora filtra la señal y deja solo fluctuaciones altamente correlacionadas. Esto proporciona una mejora del contraste y, por lo tanto, una reducción del fondo. Como se desprende de la figura de la izquierda, la distribución de la fuente de fluorescencia:

${\displaystyle \sum _{k=1}^{N}\delta ({\vec {r}}-{\vec {r}}_{k})\cdot \varepsilon _{k}\cdot s_{k}(t)}$

se convoluciona con la función de dispersión de puntos (PSF) del sistema U ( r ). Por lo tanto, la señal de fluorescencia en el tiempo t y la posición está dada por ${\displaystyle {\vec {r}}}$

${\displaystyle F({\vec {r}},t)=\sum _{k=1}^{N}U({\vec {r}}-{\vec {r}}_{k})\cdot \varepsilon _{k}\cdot s_{k}(t).}$

En las ecuaciones anteriores, N es la cantidad de emisores ubicados en las posiciones con un brillo molecular dependiente del tiempo , donde es una variable para el brillo molecular constante y es una función de fluctuación dependiente del tiempo. El brillo molecular es simplemente la tasa de recuento de fluorescencia promedio dividida por la cantidad de moléculas dentro de una región específica. Para simplificar, se debe suponer que la muestra está en un equilibrio estacionario y, por lo tanto, la señal de fluorescencia se puede expresar como una fluctuación de media cero: ${\displaystyle {\vec {r}}_{k}}$ ${\displaystyle \varepsilon _{k}\cdot s_{k}}$ ${\displaystyle \varepsilon _{k}}$ ${\displaystyle s_{k}(t)}$

${\displaystyle \delta F({\vec {r}},t)=F({\vec {r}},t)-\langle F({\vec {r}},t)\rangle _{t}}$

donde denota promediado temporal. La autocorrelación aquí, por ejemplo, de segundo orden, se puede describir deductivamente de la siguiente manera para un cierto desfase temporal : ${\displaystyle \langle \cdots \rangle _{t}}$ ${\displaystyle \tau }$

${\displaystyle \delta F({\vec {r}},t)=\langle \delta F({\vec {r}},t+\tau )\cdot \delta F({\vec {r}},t)\rangle _{t}}$

De estas ecuaciones se deduce que la PSF del sistema óptico debe elevarse a la potencia del orden de la correlación. Por lo tanto, en una correlación de segundo orden, la PSF se reduciría a lo largo de todas las dimensiones en un factor de . Como resultado, la resolución de las imágenes SOFI aumenta de acuerdo con este factor. ${\displaystyle {\sqrt {2}}}$

Cumulantes versus correlaciones

Si se utiliza únicamente la función de correlación simple para reasignar los valores de los píxeles, se podría atribuir la independencia de las fluctuaciones de los emisores en el tiempo de forma que ningún término de correlación cruzada contribuiría al nuevo valor de píxel. Los cálculos de funciones de correlación de orden superior se verían afectados por las correlaciones de orden inferior, por lo que es mejor calcular cumulantes, ya que todos los términos de correlación de orden inferior se desvanecen.

Cálculo de acumulativos

Autoacumulantes

Por razones computacionales, es conveniente establecer todos los desfases temporales en los cumulantes de orden superior en cero, de modo que se pueda encontrar una expresión general para el autocumulante de orden n : ^[3]

${\displaystyle AC_{n}({\vec {r}},\tau _{1\ldots n-1}=0)=\sum _{k=1}^{N}U^{n}({\vec {r}}-{\vec {r}}_{k})\varepsilon _{k}^{n}w_{k}(0)}$

${\displaystyle w_{k}}$es una función de ponderación basada en correlación específica influenciada por el orden del cumulante y que depende principalmente de las propiedades de fluctuación de los emisores.

Aunque no existe ninguna limitación fundamental en el cálculo de órdenes muy altos de cumulantes y, por lo tanto, en la reducción del FWHM de la PSF, existen limitaciones prácticas de acuerdo con la ponderación de los valores asignados a la imagen final. Los emisores con un brillo molecular más alto mostrarán un fuerte aumento en términos del valor de cumulante de píxeles asignado a órdenes superiores, así como también se puede esperar este rendimiento a partir de una apariencia diversa de fluctuaciones de diferentes emisores. Por lo tanto, se puede esperar un amplio rango de intensidad de la imagen resultante y, como resultado, los emisores tenues pueden quedar enmascarados por emisores brillantes en imágenes de orden superior:. ^{[3] [5]} El cálculo de autocumulantes se puede realizar de una manera muy atractiva en un sentido matemático. El cumulante de orden n se puede calcular con una recursión básica a partir de momentos ^[6]

${\displaystyle K_{n}({\vec {r}})=\mu _{n}({\vec {r}})-\sum _{i=1}^{n-1}{\begin{pmatrix}n-1\\i\end{pmatrix}}K_{n-i}({\vec {r}})\mu _{i}({\vec {r}})}$

donde K es un cumulante del orden del índice, representa también los momentos. El término entre paréntesis indica un coeficiente binomial. Esta forma de cálculo es sencilla en comparación con el cálculo de cumulantes con fórmulas estándar. Permite el cálculo de cumulantes con poco tiempo de cálculo y, como está bien implementada, es incluso adecuada para el cálculo de cumulantes de alto orden en imágenes grandes. ${\displaystyle \mu }$

Acumulantes cruzados

Principios del cálculo de SOFI de cumulantes cruzados y factor de distancia: (A) Cálculo de cumulantes cruzados de cuarto orden con "combinaciones con repeticiones". (B) Decaimiento del factor de distancia a lo largo de las flechas.

En un enfoque más avanzado, los cumulantes cruzados se calculan teniendo en cuenta la información de varios píxeles. Los cumulantes cruzados se pueden describir de la siguiente manera: ^{[5] [7]}

${\displaystyle CC_{n}({\vec {r}},\tau _{1\ldots n-1}=0)=\prod _{j<l}^{n}U{\Bigg (}{\frac {{\vec {r}}_{j}-{\vec {r}}_{l}}{\sqrt {n}}}{\Bigg )}\cdot \sum _{i=1}^{N}U^{n}{\Bigg (}{\vec {r}}_{i}-{\frac {\sum _{k}^{n}{\vec {r}}_{k}}{n}}{\Bigg )}\varepsilon _{i}^{n}w_{i}(0)}$

j , l y k son índices para los píxeles que contribuyen, mientras que i es el índice para la posición actual. Todos los demás valores e índices se utilizan como antes. La principal diferencia en la comparación de esta ecuación con la ecuación para los autocumulantes es la aparición de un factor de ponderación . Este factor de ponderación (también denominado factor de distancia) tiene forma de PSF y depende de la distancia de los píxeles correlacionados de forma cruzada, en el sentido de que la contribución de cada píxel decae a lo largo de la distancia de forma similar a la de PSF. En principio, esto significa que el factor de distancia es menor para los píxeles que están más separados. El enfoque de los autocumulantes se puede utilizar para crear nuevos píxeles virtuales que revelen información verdadera sobre la muestra etiquetada al reducir el tamaño efectivo del píxel. Estos píxeles contienen más información que los píxeles que surgen de una simple interpolación. ${\displaystyle U(r_{j}-r_{l}/{\sqrt {n}})}$

Además, el enfoque de cumulante cruzado se puede utilizar para estimar la PSF del sistema óptico haciendo uso de las diferencias de intensidad de los píxeles virtuales que se deben a la "pérdida" en la correlación cruzada como se mencionó anteriormente. ^[5] Cada píxel virtual se puede volver a ponderar con el inverso del factor de distancia del píxel, lo que conduce a una restauración del valor verdadero del cumulante. Por último, la PSF se puede utilizar para crear una dependencia de resolución de n para el cumulante de orden n volviendo a ponderar la "función de transferencia óptica" (OTF). ^[5] Este paso también se puede reemplazar utilizando la PSF para una deconvolución que está asociada con un menor costo computacional.

El cálculo de los cumulantes cruzados requiere el uso de una fórmula computacional mucho más costosa que comprende el cálculo de sumas sobre particiones. Esto se debe, por supuesto, a la combinación de diferentes píxeles para asignar un nuevo valor. Por lo tanto, no se puede utilizar un enfoque recursivo rápido en este punto. Para el cálculo de los cumulantes cruzados se puede utilizar la siguiente ecuación: ^[8]

${\displaystyle K_{n}{\Bigg (}{\vec {r}}={\frac {1}{n}}\sum _{i=1}^{n}{\vec {r_{i}}}{\Bigg )}=\sum _{P}(-1)^{|P|-1}(|P|-1)!\prod _{p\in P}{\Big \langle }\prod _{i\in p}F({\vec {r}})_{i}{\Big \rangle }_{t}}$

En esta ecuación, P denota la cantidad de particiones posibles, p denota las diferentes partes de cada partición. Además, i es el índice para las diferentes posiciones de píxeles que se tienen en cuenta durante el cálculo, lo que para F es simplemente la pila de imágenes de los diferentes píxeles contribuyentes. El enfoque de cumulante cruzado facilita la generación de píxeles virtuales en función del orden del cumulante, como se mencionó anteriormente. Estos píxeles virtuales se pueden calcular en un patrón particular a partir de los píxeles originales para una imagen de cumulante cruzado de cuarto orden, como se muestra en la imagen inferior, parte A. El patrón en sí surge simplemente del cálculo de todas las combinaciones posibles de los píxeles de la imagen original A, B, C y D. Aquí esto se hizo mediante un esquema de "combinaciones con repeticiones". Los píxeles virtuales exhiben una pérdida de intensidad que se debe a la propia correlación. La parte B de la segunda imagen representa esta dependencia general de los píxeles virtuales en la correlación cruzada. Para restaurar valores de píxeles significativos, la imagen se suaviza mediante una rutina que define un factor de distancia para cada píxel de la cuadrícula de píxeles virtuales en forma de PSF y aplica el inverso en todos los píxeles de la imagen que están relacionados con el mismo factor de distancia. ^{[5] [7]}

Referencias

1. Eric Betzig, George H. Patterson, Rachid Sougrat, O. Wolf Lindwasser, Scott Olenych, Juan S. Bonifacino, Michael W. Davidson, Jennifer Lippincott-Schwartz, Harald F. Hess: Imágenes de proteínas fluorescentes intracelulares con resolución nanométrica , Science , vol. 313, n.º 5793, 2006, págs. 1642-1645. doi :10.1126/science.1127344
2. S. vdLinde, A. Löschberger, T. Klein, M. Heidbreder, S. Wolter, M. Heilemann, M. Sauer: Microscopía de reconstrucción óptica estocástica directa con sondas fluorescentes estándar , Nature Protocols , vol. 6, 2011, págs. 991–1009. doi :10.1038/nprot.2011.336
3. T. Dertinger, R. Colyer, G. Iyer, S. Weiss, J. Enderlein: Imágenes de fluctuación óptica (SOFI) tridimensionales, rápidas y sin fondo, , PNAS , Vol. 106 núm. 52, 2009, pp. 22287–22292. doi :10.1073/pnas.0907866106
4. S. Geissbuehler, C. Dellagiacoma, T. Lasser: Comparación entre SOFI y STORM , Biomedical Optics Express , vol. 2, número 3, 2011, págs. 408-420. doi :10.1364/BOE.2.000408
5. T. Dertinger, R. Colyer, R. Vogel, J. Enderlein, S. Weiss: Lograr una mayor resolución y más píxeles con imágenes de fluctuación óptica de superresolución (SOFI) , Optics Express , vol. 18, número 18, 2010, págs. 18875–18885. doi :10.1364/OE.18.018875
6. PT Smith: Una formulación recursiva del antiguo problema de obtención de momentos a partir de cumulantes y viceversa , The American Statistician , vol. 49, número 2, 1995, págs. 217-218. doi :10.1080/00031305.1995.10476146
7. S. Geissbuehler, NL Bocchio, C. Dellagiacoma, C. Berclaz, M. Leutenegger, T. Lasser: Mapeo de estadísticas moleculares con imágenes de fluctuación óptica de súper resolución balanceada (bSOFI) , Optical Nanooscopy , vol. 1, 2012, págs. 1–4. doi :10.1186/2192-2853-1-4
8. JM Mendel: Tutorial sobre estadísticas de orden superior (espectros) en procesamiento de señales y teoría de sistemas: resultados teóricos y algunas aplicaciones , Actas del IEEE , vol. 79, número 3, 1991, págs. 278-297. doi :10.1109/5.75086