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ADN polimerasa termoestable

Taq -ADN-polimerasa con exonucleasa- (arriba a la izquierda) y dominio de polimerasa con ADN (abajo a la derecha)

Las ADN polimerasas termoestables son ADN polimerasas que se originan a partir de termófilos , generalmente especies bacterianas o arqueales, y por lo tanto son termoestables . Se utilizan para la reacción en cadena de la polimerasa y métodos relacionados para la amplificación y modificación del ADN .

Propiedades

Se han descrito varias ADN polimerasas con propiedades distintas que definen su utilización específica en una PCR, en una PCR en tiempo real o en una amplificación isotérmica . Al ser ADN polimerasas, todas las ADN polimerasas termoestables tienen una actividad polimerasa 5'→3' y una actividad exonucleasa 5'→3' o 3'→5'.

Estructura

Las ADN polimerasas tienen una forma similar a la de una mano con pulgar, palma y dedos. [12] [13] El pulgar participa en la unión y el movimiento del ADN bicatenario . [12] La palma lleva el sitio activo de la polimerasa , mientras que los dedos se unen a los sustratos (ADN molde y trifosfatos de nucleósidos ). [12] [14] La actividad de la exonucleasa se encuentra en un dominio proteico separado . [12] El Mg 2+ es un cofactor .

El sitio activo de la polimerasa en la palma cataliza la prolongación del ADN, a partir de un cebador unido a una cadena sencilla de ADN molde:

desoxinucleósido trifosfato + ADN n ⇌ pirofosfato + ADN n+1 .

Polimerasas bacterianas

Las ADN polimerasas termoestables de origen natural se encuentran en bacterias termófilas , arqueas y sus patógenos. Entre las ADN polimerasas termoestables bacterianas se utilizan la Taq polimerasa , la Tfl polimerasa, la Tma polimerasa, la Tne polimerasa, la Tth y la Bst polimerasa. [4] [15] [16] [2]

Además de la actividad polimerasa 5'→3', las ADN polimerasas termoestables bacterianas (que pertenecen a las ADN polimerasas de tipo A) tienen actividad exonucleasa 5'→3' y generan un saliente de adenosina ( extremos pegajosos ) en el extremo 3' de la cadena recién generada. El fragmento Klenow de Bst (BF) tiene una actividad de desplazamiento de cadena que permite su uso en la amplificación isotérmica sin la necesidad de desnaturalizar el ADN en un termociclador , y su actividad exonucleasa 5'→3' se elimina para un mayor rendimiento. [2]

Polimerasas arqueales

Polimerasa Pfu con dos iones de magnesio (esferas grises)

Las polimerasas de ADN de tipo B que se utilizan con frecuencia son la polimerasa Pfu , [4] la polimerasa Pwo, [17] la polimerasa KOD, [3] la polimerasa Tli (también llamada Vent), que se origina en varias arqueas, [18] la polimerasa Tag, [19] la polimerasa Tce, [20] la polimerasa Tgo, [8] la polimerasa TNA1, [21] la polimerasa Tpe, [22] la polimerasa Tthi, [23] la polimerasa Neq [24] y la polimerasa Pab. [25]

Las variantes arqueales (pertenecientes al tipo B) producen extremos romos (la polimerasa Tli produce un saliente en aproximadamente el 30% de los productos) y en lugar de la actividad exonucleasa 5'→3' tienen una actividad para corregir errores de síntesis (corrección de pruebas), la actividad exonucleasa 3'→5'. [26] [27] En las polimerasas arqueales, la tasa de error se ve afectada cuando se genera un análogo del fragmento Klenow, ya que la actividad exonucleasa correctora se elimina en el proceso. [4] Algunas ADN polimerasas arqueales se caracterizan menos por su idoneidad para la PCR estándar que por su inhibición reducida en la amplificación de A-ADN [28] o ADN con bases modificadas. [29] [30]

Polimerasas modificadas

Varias proteínas de fusión con la baja tasa de error de las ADN polimerasas termoestables arqueales y la alta tasa de síntesis de las ADN polimerasas bacterianas ( Q5 polimerasa ) se generaron a partir de varias polimerasas termoestables y la abrazadera de ADN de la proteína de unión al ADN termoestable SSo7d mediante diseño de proteínas . [31] También se generó una proteína de fusión del homólogo de PCNA de Archaeoglobus fulgidus con ADN polimerasas termoestables arqueales. [32] De manera similar, se generaron proteínas de fusión de ADN polimerasas termoestables con el dominio de proteína de unión al ADN termoestable de una topoisomerasa (tipo V, con motivo hélice-horquilla-hélice, HhH) de Methanopyrus kandleri ( TopoTaq y PfuC2 ). [33] [34] También se generó una polimerasa Pfu modificada mediante diseño de proteínas ( Pfu Ultra ). [35] También se logran efectos similares con mezclas de ADN polimerasas termoestables de ambos tipos con una relación de mezcla de las actividades enzimáticas de las polimerasas de tipo A y B de 30 a 1, [22] [36] por ejemplo, Herculase [8] y TaqPlus [10] como una mezcla comercial de Taq y polimerasa Pfu, Expand como una mezcla comercial de Taq y Pwo, [37] Expand High Fidelity como una mezcla comercial de Taq y Tgo, [10] Platinum Taq High Fidelity como una mezcla comercial de Taq y Tli (Vent), [10] y Advantage HF 2 como una mezcla comercial de Titanium Taq y una polimerasa de corrección de pruebas sin nombre. [10] Estas mezclas se pueden utilizar para PCR de largo alcance para sintetizar productos de hasta 35 kb de longitud. [36] [38] Se utilizan otros aditivos para ayudar contra secuencias difíciles ricas en G C , evitar o neutralizar los efectos negativos de los inhibidores de PCR (como componentes sanguíneos o detergentes [39] o dUTP [40] ), o alterar la cinética de la reacción . [41]

Velocidad y procesividad

Se han comparado las tasas de síntesis de referencia (velocidad, productividad) de varias polimerasas. [8] La tasa de síntesis de la polimerasa Taq es de alrededor de 60 pares de bases por segundo. Entre las ADN polimerasas termoestables no modificadas, solo la tasa de síntesis de la polimerasa KOD es superior a 100 pares de bases por segundo (aproximadamente 120 pb/s). [11] Entre las ADN polimerasas termoestables modificadas, se han descrito varias mutaciones que aumentan la tasa de síntesis. [42] [43] [44] La polimerasa KOD y algunas ADN polimerasas termoestables modificadas ( iProof / Phusion , Pfu Ultra , Velocity o Z-Taq ) se utilizan como una variante de PCR con ciclos de amplificación más cortos (PCR rápida, PCR de alta velocidad) debido a su alta tasa de síntesis. La procesividad describe el número promedio de pares de bases antes de que una polimerasa se desprenda de la plantilla de ADN. La procesividad de la polimerasa limita la distancia máxima entre el cebador y la sonda en algunas formas de PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR).

Fidelidad

Se han descrito las tasas de error de varias polimerasas (fidelidad). La tasa de error de la polimerasa Taq es de 8 × 10 −6 errores por base, la de Advantage HF de 6,1 × 10 −6 errores por base, la de Platinum Taq High Fidelity de 5,8 × 10 −6 errores por base y duplicación, la de TaqPlus de 4 × 10 −6 errores por base y duplicación, la de la polimerasa KOD de 3,5 × 10 −6 errores por base y duplicación, la de la polimerasa Tli y Herculase de 2,8 × 10 −6 errores por base y duplicación, la de Deep Vent de 2,8 × 10 −6 errores por base y duplicación, la de Pfu, Phusion DNA Polymerase (idéntica a iProof DNA Polymerase ) y Herculase II Fusion de 1,3 × 10 −6 errores por base y duplicación. por base y duplicación y la de Pfu Ultra y Pfu Ultra II 4,3 × 10 −7 errores por base y duplicación. [4] [8] [10] Un análisis más reciente encontró tasas de error ligeramente diferentes: Deep Vent (exo-) polimerasa (5,0 × 10 −4 errores por base y duplicación), Taq polimerasa (1,5 × 10 −4 errores por base y duplicación), Kapa HiFi HotStart ReadyMix (1,6 × 10 −5 errores por base y duplicación), KOD (1,2 × 10 −5 errores por base y duplicación), PrimeSTAR GXL (8,4 × 10 −6 errores por base y duplicación), Pfu (5,1 × 10 −6 errores por base y duplicación), Deep Vent ADN polimerasa (4,0 × 10 −6 ) errores por base y duplicación, Phusion (3,9 × 10 −6 errores por base y duplicación), duplicación) y la ADN polimerasa Q5 (5,3 × 10 −7 errores por base y duplicación). [5] Otro estudio encontró tasas de error de 3-5,6 × 10 −6 para Taq, 7,6 × 10 −6 para KOD, 2,8 × 10 −6 para Pfu, 2,6 × 10 −6 para Phusion y 2,4 × 10 −6 para Pwo. [6] Para reducir el número de mutaciones en el producto de PCR (por ejemplo, para la clonación molecular ), se pueden utilizar más ADN molde y menos ciclos en la PCR. [10]

Producir

Las ADN polimerasas termoestables bacterianas generalmente producen concentraciones de producto más altas que las arqueales, pero con más errores de copia. En las ADN polimerasas termoestables bacterianas, se puede generar un fragmento Klenow ( Klen-Taq ) o un fragmento Stoffel eliminando el dominio de exonucleasa en el curso del diseño de la proteína, de manera análoga a la ADN polimerasa de E. coli , lo que da como resultado una mayor concentración de producto. [45] [15] Dos aminoácidos necesarios para la función de exonucleasa de la Taq polimerasa se identificaron por mutagénesis como argininas en las posiciones 25 y 74 (R25 y R74). [46] Una mutación de histidina a ácido glutámico en la posición 147 (abreviatura: H147E) en la KOD polimerasa reduce la actividad de exonucleasa relativamente alta de KOD. [27]

Especificidad de nucleótidos

La preferencia de nucleótidos individuales por una ADN polimerasa termoestable se conoce como especificidad de nucleótidos (sesgo). En la secuenciación de ADN basada en PCR con sustratos de terminación de cadena (método didesoxi), a menudo se desea su incorporación uniforme y, por lo tanto, la generación imparcial de todos los productos de terminación de cadena para permitir una mayor sensibilidad y un análisis más fácil. Para este propósito, se generó una polimerasa KlenTaq por deleción y se intercambió una fenilalanina en la posición 667 por tirosina mediante mutagénesis dirigida al sitio (abreviatura: F667Y) y se denominó Thermo Sequenase . [47] [48] Esta polimerasa también se puede utilizar para la incorporación de didesoxinucleótidos marcados con fluorescencia. [49]

Polimerasas de ADN termoestables de arranque en caliente

La especificidad de la plantilla de las polimerasas aumenta mediante el uso de polimerasas de inicio en caliente, para evitar la unión de los cebadores a plantillas de ADN no deseadas o entre sí a bajas temperaturas antes del comienzo de la PCR. [50] Algunos ejemplos son la polimerasa Pfu inhibida por anticuerpos Pfu Turbo , la Platinum Pfx como una polimerasa KOD comercial con un anticuerpo inhibidor y la Platinum Taq como una polimerasa Taq inhibida por anticuerpos. [8] Las polimerasas de inicio en caliente se inhiben ya sea por inactivación con formaldehído [51] [52] (o anhídrido maleico , anhídrido exo-cis-3,6-endoxo-Δ4-tetrahidroftálico, anhídrido citracónico, anhídrido 3,4,5,6-tetrahidroftálico, anhídrido cis-aconítico o anhídrido 2,3-dimetilmaleico), [53] mediante la formación de complejos de magnesio con fosfatos [54] o mediante la unión de un anticuerpo a su sitio activo. [55] [56] Al calentar a 95 °C, el formaldehído se disocia de las proteínas, [57] [58] [59] o se liberan los iones de magnesio, [54] o el anticuerpo se desnaturaliza y se libera en el proceso. [60] [61] Además, las polimerasas se pueden inhibir con aptámeros que se desnaturalizan al calentar. [62] [63] Una quinta variante es una polimerasa adsorbida en perlas de látex a través de efectos hidrofóbicos , que se disuelve al aumentar la temperatura. En la sexta y más antigua variante, la mezcla de reacción sin polimerasa se recubre con cera y la polimerasa se agrega sobre la cera enfriada. Cuando se calienta, la capa de cera se derrite y la polimerasa se mezcla con la mezcla de reacción. [64]

Otras polimerasas de ADN

Algunas ADN polimerasas utilizadas en la amplificación isotérmica de ADN, por ejemplo, en la amplificación isotérmica mediada por bucle , la amplificación por desplazamiento múltiple , la amplificación por polimerasa recombinasa o el ensamblaje isotérmico , para la amplificación de genomas completos (por ejemplo, la ADN polimerasa φ29 del bacteriófago phi29 , B35DNAP del fago Bam35) no son termoestables, mientras que otras como el fragmento Bst Klenow son termoestables. [65] Las ADN polimerasas T4, T6 y T7 tampoco son termoestables.

Polimerasas de ADN dependientes de ARN

Las transcriptasas inversas estándar (polimerasas de ADN dependientes de ARN) de origen retroviral utilizadas para RT-PCR , como la transcriptasa inversa AMV y MoMuLV , no son termoestables a 95 °C. A las temperaturas más bajas de una transcripción inversa , puede ocurrir una hibridación inespecífica de cebadores con secuencias erróneas, así como estructuras secundarias no deseadas en la plantilla de ADN, lo que puede conducir a productos de PCR no deseados y productos de PCR menos deseados. La transcriptasa inversa AMV se puede utilizar hasta 70 °C. [66] Además, algunas polimerasas de ADN dependientes de ADN termoestables se pueden utilizar como polimerasas de ADN dependientes de ARN intercambiando Mg 2+ como cofactores con Mn 2+ , de modo que puedan usarse para una RT-PCR. [67] Pero como la tasa de síntesis de Taq con Mn 2+ es relativamente baja, Tth se utilizó cada vez más para este enfoque. [68] El uso de Mn 2+ también aumenta la tasa de error y la cantidad necesaria de plantilla, por lo que este método rara vez se utiliza. Estos problemas se pueden evitar con la termoestable 3173 -Polimerasa de un bacteriófago termófilo , que puede soportar las altas temperaturas de una PCR y prefiere el ARN como plantilla. [69]

Aplicaciones

Además de la elección de la ADN polimerasa termoestable, otros parámetros de una PCR se modifican específicamente en el curso de la optimización de la PCR.

Además de la PCR, las ADN polimerasas termoestables también se utilizan para variantes de RT-PCR , qPCR en diferentes variantes, mutagénesis específica de sitio y secuenciación de ADN. También se utilizan para producir sondas de hibridación para Southern blot y Northern blot mediante cebado aleatorio. La actividad de la exonucleasa 5'→3' se utiliza para la traducción de mellas y TaqMan , entre otras cosas, sin replicación de ADN (amplificación).

Historia

Alice Chien y sus colegas fueron los primeros en caracterizar la polimerasa Taq termoestable en 1976. [70] El primer uso de una ADN polimerasa termoestable fue por Randall K. Saiki y sus colegas en 1988, introduciendo la polimerasa Taq para PCR. [71] [72] La termoestabilidad de la polimerasa Taq evitó la necesidad de agregar una ADN polimerasa no termoestable a la reacción después de cada fase de fusión de la PCR, porque la polimerasa Taq no se desnaturaliza al calentar a 95 °C durante la fase de fusión de cada ciclo. En 1989, el gen de la polimerasa Taq fue clonado y la polimerasa Taq se produjo en Escherichia coli como una proteína recombinante . [73] [72] Wayne M. Barnes sintetizó ADN de hasta 35.000 pares de bases utilizando diferentes mezclas de polimerasas de tipo A y B, [36] [72] creando así la PCR de largo alcance. En 1997, Masahiro Takagi y sus colegas publicaron la alta tasa de síntesis de la polimerasa KOD [3] [72] [14] , creando así los fundamentos de la PCR de alta velocidad. En los años siguientes se desarrollaron otras optimizaciones de la PCR, por ejemplo, evitando los inhibidores de la PCR y amplificando secuencias de ADN ricas en GC difíciles, [41] así como modificando las polimerasas de ADN termoestables mediante el diseño de proteínas. En 1998, Tsugunori Notomi y sus colegas de Eiken Chemical Company desarrollaron la amplificación isotérmica mediada por bucle , utilizando la polimerasa Bst a 65 °C. [74] [75]

Lectura adicional

Enlaces externos

Referencias

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