La ribonucleasa pancreática bovina , también conocida como ribonucleasa pancreática bovina A o simplemente ARNasa A , es una enzima ribonucleasa pancreática que escinde el ARN monocatenario . La ribonucleasa pancreática bovina es uno de los sistemas modelo clásicos de la ciencia de las proteínas . [1] Se han otorgado dos premios Nobel de Química en reconocimiento al trabajo sobre la ribonucleasa pancreática bovina: en 1972, el premio fue otorgado a Christian Anfinsen por su trabajo sobre el plegamiento de proteínas y a Stanford Moore y William Stein por su trabajo sobre la relación entre la estructura de la proteína y su mecanismo químico ; [2] en 1984, el premio fue otorgado a Robert Bruce Merrifield por el desarrollo de la síntesis química de proteínas. [3]
La ribonucleasa pancreática bovina se convirtió en un sistema modelo común en el estudio de las proteínas en gran medida porque era extremadamente estable y podía purificarse en grandes cantidades. En la década de 1940, Armour and Company purificó un kilogramo de proteína (una cantidad muy grande, particularmente para los estándares de purificación de proteínas de la época) y ofreció muestras a bajo costo a los científicos interesados. [4] La capacidad de tener un solo lote de enzima purificada la convirtió en un sistema modelo predominante para los estudios de proteínas. Sigue siendo conocida comúnmente como ribonucleasa A o ARNasa A como el miembro más destacado de su familia de proteínas , conocida como ribonucleasa pancreática , ribonucleasa A o ribonucleasa I.
Los estudios de Christian Anfinsen sobre el proceso de plegamiento oxidativo de la ribonucleasa pancreática bovina sentaron las bases para comprender la relación entre la secuencia de aminoácidos y la estructura tridimensional plegada de una proteína y solidificaron la hipótesis termodinámica del plegamiento de proteínas, según la cual la forma plegada de una proteína representa su mínimo de energía libre . [4] [5]
La ARNasa A fue la primera enzima para la que se propuso un mecanismo catalítico correcto , incluso antes de que se conociera su estructura. [6] La ARNasa A fue la primera proteína que mostró los efectos de los isómeros no nativos de los enlaces peptídicos que preceden a los residuos de prolina en el plegamiento de proteínas. [7]
La ribonucleasa pancreática bovina también fue la proteína modelo utilizada para desarrollar muchos métodos espectroscópicos para ensayar la estructura de las proteínas, incluyendo absorbancia , dicroísmo circular , Raman , resonancia paramagnética electrónica (EPR) y espectroscopia de resonancia magnética nuclear (NMR). Fue la primera proteína modelo para el desarrollo de métodos químicos para el estudio de proteínas, como la modificación química de cadenas laterales expuestas, el reconocimiento antigénico y la proteólisis limitada de segmentos desordenados. La ribonucleasa S, que es la ARNasa A que ha sido tratada con la proteasa subtilisina , fue la tercera proteína en tener su estructura cristalográfica resuelta, en 1967. [8]
La ARNasa A es una proteína relativamente pequeña (124 residuos, ~13,7 kDa). Se puede caracterizar como una proteína de dos capas con una hendidura profunda para unir el sustrato de ARN. La primera capa está compuesta por tres hélices alfa (residuos 3-13, 24-34 y 50-60) de la mitad N-terminal de la proteína. La segunda capa consta de tres horquillas β (residuos 61-74, 79-104 y 105-124 de la mitad C-terminal) dispuestas en dos láminas β . Las horquillas 61-74 y 105-124 forman una lámina β antiparalela de cuatro cadenas que se encuentra en la hélice 3 (residuos 50-60). La horquilla β más larga 79-104 se acopla con una hebra β corta (residuos 42-45) para formar una lámina β antiparalela de tres cadenas que se encuentra en la hélice 2 (residuos 24-34).
La ARNasa A tiene cuatro enlaces disulfuro en su estado nativo: Cys26-Cys84, Cys58-110, Cys40-95 y Cys65-72. Los dos primeros (26-84 y 58-110) son esenciales para el plegamiento conformacional; cada uno une una hélice alfa de la primera capa a una lámina beta de la segunda capa, formando un pequeño núcleo hidrofóbico en su proximidad. Los dos últimos enlaces disulfuro (40-95 y 65-72) son menos esenciales para el plegamiento; cualquiera de ellos puede reducirse (pero no ambos) sin afectar la estructura nativa en condiciones fisiológicas. Estos enlaces disulfuro conectan segmentos de bucle y están relativamente expuestos al disolvente. El enlace disulfuro 65-72 tiene una propensión extraordinariamente alta a formarse, significativamente más de lo que se esperaría de su entropía de bucle , tanto como péptido como en la proteína de longitud completa. Esto sugiere que la horquilla β 61-74 tiene una alta propensión a plegarse conformacionalmente.
La ARNasa A es una proteína básica (p I = 9,63); sus numerosas cargas positivas son consistentes con su unión al ARN (un polianión ) . En términos más generales, la ARNasa A es inusualmente polar o, más bien, inusualmente carente de grupos hidrofóbicos, especialmente alifáticos. Esto puede explicar su necesidad de cuatro enlaces disulfuro para estabilizar su estructura. El bajo contenido hidrofóbico también puede servir para reducir la repulsión física entre los grupos altamente cargados (los suyos y los de su ARN sustrato) y las regiones de baja constante dieléctrica (los residuos no polares).
La hélice α N-terminal de la ARNasa A (residuos 3-13) está conectada al resto de la ARNasa A mediante un enlace flexible (residuos 16-23). Como demostró FM Richards, este enlace puede ser escindido por la subtilisina entre los residuos 20 y 21 sin provocar que la hélice N-terminal se disocie del resto de la ARNasa A. El complejo péptido-proteína se denomina "ARNasa S", el péptido (residuos 1-20) se denomina "péptido S" y el resto (residuos 21-124) se denomina "proteína S". La constante de disociación del péptido S para la proteína S es de aproximadamente 30 pM; esta unión estrecha se puede aprovechar para la purificación de proteínas uniendo el péptido S a la proteína de interés y haciendo pasar una mezcla por una columna de afinidad con la proteína S unida. [También funciona un péptido C más pequeño (residuos 1-13).] El sistema modelo de la ARNasa S también se ha utilizado para estudiar el plegamiento de proteínas mediante el acoplamiento del plegamiento y la asociación. El péptido S fue el primer péptido de una proteína nativa que demostró tener una estructura secundaria (parpadeante) de forma aislada (por Klee y Brown en 1967).
La ARNasa A corta específicamente los nucleótidos de pirimidina . [9] La escisión se lleva a cabo en dos pasos: primero, se corta el enlace 3',5'-fosfodiéster para generar un intermedio 2',3'-fosfodiéster cíclico; segundo, el fosfodiéster cíclico se hidroliza a un 3'-monofosfato. [10] Puede ser inhibida por la proteína inhibidora de ribonucleasa , por iones de metales pesados y por complejos de uridina-vanadato. [10]
Las cargas positivas de la ARNasa A se encuentran principalmente en una hendidura profunda entre dos lóbulos. El sustrato de ARN se encuentra en esta hendidura y es escindido por dos residuos catalíticos de histidina , His12 e His119, para formar un intermediario de fosfato cíclico 2',3' que es estabilizado por la Lys41 cercana.
Esta proteína puede utilizar el modelo de morfeína de regulación alostérica . [11]
