Los estándares para la identificación de la muerte celular han cambiado. La muerte celular solía definirse y describirse en función de la morfología . Ahora hay un cambio en la clasificación basándose en definiciones moleculares y genéticas. Esta descripción es más funcional y se aplica tanto in vitro como in vivo , por lo que las subrutinas de muerte celular ahora se describen mediante una serie de características bioquímicas precisas y mensurables. En 2009, el Comité de Nomenclatura sobre Muerte Celular (NCCD) propuso un conjunto de recomendaciones para describir la terminología de la muerte celular, porque el uso incorrecto de palabras y conceptos puede ralentizar el progreso en el área de investigación de la muerte celular. [1]
La definición clásica de muerte la define como un estado caracterizado por el cese de los signos de vida. Es cuando una célula ha perdido la integridad de su membrana plasmática y/o ha sufrido una desintegración completa, incluido su núcleo, y/o sus fragmentos han sido engullidos por una célula vecina in vivo. Está causada por un desequilibrio funcional irreversible y el colapso de la organización interna de un sistema. El papel de la muerte celular es el mantenimiento de la homeostasis de los tejidos y órganos , por ejemplo, la pérdida regular de células de la piel o un papel más activo observado en tejidos involutivos como el timo.
Las células mueren por accidente o por diseño. De hecho, existen dos mecanismos de muerte celular: la necrosis y la apoptosis (la apoptosis en los invertebrados se denomina deleción celular). Las células moribundas participan en un proceso que es reversible hasta que se traspasa una primera fase irreversible o "punto de no retorno".
La necrosis es una muerte no programada de las células, que implica cambios tempranos en la membrana plasmática que conducen a la pérdida del desequilibrio de calcio y sodio. Esto causa acidosis, choque osmótico, aglutinación de la cromatina y picnosis nuclear . Estos cambios se acompañan de una pérdida de la fosforilación oxidativa , una caída en la producción de ATP y una pérdida de la capacidad homeostática. También hay cambios mitocondriales que incluyen sobrecarga de calcio y activación de fosfolipasas que conducen a señales de difusión de membrana, una etapa de daño irreversible. La etapa secundaria implica hinchazón del lisosoma , dilatación del retículo endoplasmático, una fuga de enzimas y proteínas y una pérdida de compartimentación.
La apoptosis, o muerte celular programada, se caracteriza generalmente por características morfológicas distintivas y mecanismos bioquímicos dependientes de la energía. Se considera un componente vital de varios procesos de la vida, entre ellos la renovación celular normal, el desarrollo y el funcionamiento adecuados del sistema inmunitario, la atrofia dependiente de hormonas, el desarrollo embrionario y la muerte celular inducida por sustancias químicas. Por ejemplo, la diferenciación de los dedos de las manos y de los pies en un embrión humano en desarrollo se produce porque las células entre los dedos sufren apoptosis, lo que da lugar a dedos separados.
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El método morfométrico es una forma de demostrar la muerte celular en el laboratorio. La medición morfométrica proporciona el resultado de la muerte celular en forma de volumen, tamaño, peso y longitud del tejido, órgano y el organismo completo, comparándolo con el antes y el después de la muerte celular. [2] Este método fue observado por Attalah y Johnson, quienes utilizaron análisis de partículas electrónicas para determinar la viabilidad celular.
Otro indicador de muerte celular es la hidrólisis ácida, que se libera durante la digestión durante la fagocitosis de las células muertas por los macrófagos o las células vecinas, y el colorante intravital es un marcador de fagocitosis secundaria.
Para demostrar la muerte celular en algunos casos se utiliza un colorante vital para detectar cuando la función celular se altera. Este procedimiento utiliza tejido vivo que se sumerge en una solución diluida 1:0000 de sulfato azul de Nilo en solución salina . La medición de la muerte celular mediante el uso de este colorante es observar un cambio de color o la formación de fluorescencia . Cuando la célula murió, el núcleo pasó por etapas de destrucción, una de ellas la picnosis, que condujo a la liberación de un grupo histónico básico y esto sucedió cuando se produjo la condensación irreversible de las cromatinas. El proceso de fagocitosis tuvo lugar en lisosomas secundarios y la autofagia y heterofagia controlaron la célula muerta por actividad de hidrólisis ácida. Las técnicas utilizadas para explicar esto es mediante la detección de la actividad de (6-3H)-timidina y fosfatos ácidos en criostato.
La muestra se inyectó con (6-3H)-timidina y luego se sacrificó el tejido, se retiró después de 1 hora y se enfrió en nitrógeno líquido. Luego se cortaron secciones de criostato de 4 μm y se montaron en cubreobjetos limpios, los cubreobjetos se mantuvieron con las secciones en el criostato, se fijaron en acetona analar fría durante 10 minutos y los cubreobjetos se enjuagaron en tampón e incubaron en medio de fosfato ácido (15 minutos). Se utilizó fosfato de naftol AS TR [3] como sustrato y paraosanilina de hexazonio como acoplador. Nuevamente, las secciones se enjuagaron completamente en agua destilada y las secciones se sumergieron en emulsión de autorradiografía (I1ford L4 diluido 1:5). Las preparaciones se expusieron a (0-4 °C) de 2 a 3 semanas en una habitación oscura. La lámina fotográfica se procesó, se contratiñó con hematoxilina y se montó para microscopía .
El resultado de este experimento es el color rojo que se produce con la técnica de coloración azoica que se ha realizado anteriormente y que es un indicador de que se ha producido la autolisis celular. Este era el objetivo principal del método morfométrico. Otro aspecto es la producción de granos de plata en la emulsión fotográfica .
Este cambio de color se debe a la reacción homogénea de color rojo de la actividad de la fosfatasa ácida. En el lisosoma hay muchos indicios de muerte celular, como la hidrolasa libre. La incorporación de timidina tritiada da lugar a granos de plata en la emulsión fotográfica que se produce en los núcleos celulares. El tejido ideal para este procedimiento es el timo. Esta discusión se centra en dos cambios que se producen en el timo del ratón como ejemplo de estudio. El primer cambio es la proporción de células que mueren (difundiendo la fosfatasa ácida) y el segundo es la incorporación de timidina en las células (células que sintetizan ADN). Los resultados se comparan según la edad del ratón. Después de medir las proporciones y los números, la conclusión es que el nivel de muerte celular en el timo en involución se duplicó en comparación con el timo joven y la timidina disminuyó en el timo más viejo en comparación con el timo joven. Para demostrar aún más estos resultados, se observó que algunos timocitos contenían sitios lisosomales de actividad de fosfatasa ácida. Cuando los macrófagos engullían las células moribundas, los niveles de fosfatasa ácida aumentaban.
Lewis empleó la incorporación autorradiográfica de 3H-timidina para calcular índices mitóticos y estimar índices picnóticos. Esta técnica puede emplearse para estudiar la cinética tisular de tumores y tiene aplicaciones en el microscopio electrónico de barrido . [4]
Hodges y Muir (1975) emplearon el microscopio electrónico de barrido para estudiar la autorradiografía. Este enfoque se combinó con el método citoquímico para demostrar el fosfato ácido libre y la lisis celular . Las células moribundas que son ricas en fosfato ácido libre contendrán un producto de reacción bromado y darán una señal característica de bromo cuando se sometan a un microanálisis de rayos X. Estudios estructurales finos Hay cambios estructurales finos comunes que ocurren en las células moribundas. Esto se concluyó después de algunos intentos de científicos como Kerr (1972) que propuso el concepto general de apoptosis en vertebrados, mientras que Scheweichel y Merker (1973) describieron la muerte celular inducida y fisiológica en tejidos de ratones prenatales. Usando distinciones estructurales finas, es posible reconocer y diferenciar entre los tipos de muerte celular, fosfato ácido y deleción celular:
El fosfato ácido es una enzima o un grupo de isoenzimas que se pueden utilizar para demostrar la muerte celular y que se puede observar fácilmente con un microscopio electrónico. La actividad del fosfato de p-nitrofenilo se puede utilizar como un buen marcador de la muerte celular. Este marcador se ha utilizado para localizar la muerte celular en las células durante el desarrollo embriológico y el resultado observado fue la liberación de fosfato ácido no lisosomal exoplásmico. Esto aparece como un signo de muerte celular. Hay muchos experimentos que muestran que el fosfato de p-nitrofenilo ectoplasmático que se libera está relacionado con los ribosomas, no con los lisosomas.
La muerte celular programada implica el control genético del proceso, por lo que deben estar presentes los genes que especifican la muerte celular en una secuencia de desarrollo. Muchos autores demuestran que puede haber un aumento premonitorio de la síntesis de proteínas como desencadenante de la muerte celular programada.
