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Hibridación ADN-ADN

En genómica , la hibridación ADN-ADN es una técnica de biología molecular que mide el grado de similitud genética entre secuencias de ADN . Se utiliza para determinar la distancia genética entre dos organismos y se ha utilizado ampliamente en filogenia y taxonomía . [1]

Método

El ADN de un organismo se etiqueta y luego se mezcla con el ADN no etiquetado para compararlo. La mezcla se incuba para permitir que las cadenas de ADN se disocien y luego se enfría para formar un ADN híbrido de doble cadena renovado. Las secuencias hibridadas con un alto grado de similitud se unirán con mayor firmeza y requerirán más energía para separarlas: es decir, se separan cuando se calientan a una temperatura más alta que las secuencias diferentes, un proceso conocido como " fusión del ADN ". [2] [3] [4]

Para evaluar el perfil de fusión del ADN hibridado, el ADN bicatenario se une a una columna o filtro y la mezcla se calienta en pequeños pasos. En cada paso, se lava la columna o el filtro; las secuencias que se funden se convierten en secuencias monocatenarias y se eliminan. Las temperaturas a las que se desprende el ADN marcado reflejan el grado de similitud entre las secuencias (y la muestra de autohibridación sirve como control). Estos resultados se combinan para determinar el grado de similitud genética entre los organismos. [5]

Se introdujo un método para hibridar una gran cantidad de muestras de ADN con numerosas sondas de ADN en una sola membrana. Las muestras debían separarse en carriles individuales dentro de la membrana, que luego se rotarían para permitir la hibridación simultánea con múltiples sondas de ADN. [6]

Usos

Cuando se comparan varias especies, los valores de similitud permiten organizar los organismos en un árbol filogenético ; por lo tanto, es un enfoque posible para realizar sistemática molecular . [ cita requerida ]

En microbiología

La hibridación ADN-ADN (DDH) se utiliza como método principal para distinguir especies bacterianas, ya que es difícil clasificarlas visualmente con precisión. [7] Esta técnica no se utiliza ampliamente en organismos más grandes, donde las diferencias entre especies son más fáciles de identificar. A fines del siglo XX, se consideraba que las cepas pertenecían a la misma especie si tenían un valor de similitud ADN-ADN mayor del 70 % y sus temperaturas de fusión estaban dentro de los 5 °C entre sí. [8] [9] [10] En 2014, se sugirió un umbral de similitud del 79 % para separar subespecies bacterianas. [11]

La DDH es una técnica común para las bacterias, pero requiere mucho trabajo, es propensa a errores y presenta un gran desafío técnico. En 2004, se describió una nueva técnica DDH. Esta técnica utilizaba microplacas y ADN marcado colorimétricamente para reducir el tiempo necesario y aumentar la cantidad de muestras que se podían procesar. [12] Esta nueva técnica DDH se convirtió en el estándar para la taxonomía bacteriana. [13]

En zoología

Charles Sibley y Jon Ahlquist , pioneros de la técnica, utilizaron la hibridación ADN-ADN para examinar las relaciones filogenéticas de las aves (la taxonomía Sibley-Ahlquist ) y los primates. [14] [15]

En radiactividad

En 1969, Mary Lou Pardue y Joseph G. Gall realizaron uno de esos métodos en la Universidad de Yale mediante radiactividad, donde implicaba la hibridación de un ADN de prueba radiactivo en solución con el ADN estacionario de una preparación citológica, lo que se identifica como autorradiografía. [16]

Reemplazo por secuenciación del genoma

Los críticos argumentan que la técnica es inexacta para la comparación de especies estrechamente relacionadas, ya que cualquier intento de medir las diferencias entre secuencias ortólogas entre organismos se ve superado por la hibridación de secuencias parálogas dentro del genoma de un organismo. [17] [ se necesita una mejor fuente ] [ se necesita una mejor fuente ] La secuenciación de ADN y las comparaciones computacionales de secuencias son ahora generalmente el método para determinar la distancia genética, aunque la técnica todavía se utiliza en microbiología para ayudar a identificar bacterias. [18]

En silicométodos

El enfoque moderno es llevar a cabo la hibridación ADN-ADN in silico utilizando genomas secuenciados total o parcialmente . [19] El GGDC y el TYGS desarrollados en DSMZ son las herramientas más precisas conocidas para calcular valores análogos a DDH. [19] Entre otras mejoras algorítmicas, resuelve el problema con secuencias parálogas filtrándolas cuidadosamente de las coincidencias entre las dos secuencias del genoma. El método se ha utilizado para resolver taxones difíciles como Escherichia coli , el grupo Bacillus cereus y Aeromonas . [20] La Comisión Judicial del Comité Internacional de Sistemática de Procariotas ha admitido dDDH como evidencia taxonómica. [21]

Véase también

Referencias

  1. ^ Erko Stackebrandt (8 de septiembre de 2010). Identificación molecular, sistemática y estructura poblacional de procariotas. Springer Science & Business Media. ISBN 978-3-540-31292-5.
  2. ^ Sinden, Richard R. (1994). Estructura y función del ADN. San Diego: Academic Press. pp. 37–45. ISBN 0-12-645750-6.OCLC 30109829  .
  3. ^ Herramientas y técnicas en la ciencia biomolecular. Aysha Divan, Janice Royds. Oxford: Oxford University Press. 2013. ISBN 978-0-19-969556-0.OCLC 818450218  .{{cite book}}: CS1 maint: others (link)
  4. ^ Forster, AC; McInnes, JL; Skingle, DC; Symons, RH (11 de febrero de 1985). "Sondas de hibridación no radiactivas preparadas mediante el marcaje químico de ADN y ARN con un nuevo reactivo, la fotobiotina". Nucleic Acids Research . 13 (3): 745–761. doi :10.1093/nar/13.3.745. ISSN  0305-1048. PMC 341032 . PMID  2582358. 
  5. ^ Hood, DW; Dow, CS; Green, PN (1987). "Estudios de hibridación ADN:ADN en los metilotrofos facultativos pigmentados de rosa". Journal of General Microbiology . 133 (3): 709–720. doi : 10.1099/00221287-133-3-709 . ISSN  0022-1287. PMID  3655730.
  6. ^ Socransky, SS; Smith, C.; Martín, L.; Paster, BJ; Dewhirst, FE; Levin, AE (octubre de 1994). "Hibridación ADN-ADN en "tablero de ajedrez". BioTechniques . 17 (4): 788–792. ISSN  0736-6205. PMID  7833043.
  7. ^ Auch, Alexander F.; von Jan, Mathias; Klenk, Hans-Peter; Göker, Markus (2010). "Hibridación digital ADN-ADN para la delineación de especies microbianas mediante la comparación de secuencias genoma a genoma". Estándares en Ciencias Genómicas . 2 (1): 117–134. doi :10.4056/sigs.531120. ISSN  1944-3277. PMC 3035253 . PMID  21304684. 
  8. ^ Brenner DJ (1973). "Reasociación del ácido desoxirribonucleico en la taxonomía de las bacterias entéricas". Revista internacional de bacteriología sistemática . 23 (4): 298–307. doi : 10.1099/00207713-23-4-298 .
  9. ^ Wayne LG, Brenner DJ, Colwell RR, Grimont PD, Kandler O, Krichevsky MI, Moore LH, Moore WEC, Murray RGE, Stackebrandt E, Starr MP, Trüper HG (1987). "Informe del comité ad hoc sobre la conciliación de enfoques de la sistemática bacteriana". Revista internacional de bacteriología sistemática . 37 (4): 463–464. doi : 10.1099/00207713-37-4-463 .
  10. ^ Tindall BJ, Rossello-Mora R, Busse HJ, Ludwig W, Kampfer P (2010). "Notas sobre la caracterización de cepas procariotas con fines taxonómicos". Revista internacional de microbiología sistemática y evolutiva . 60 (Pt 1): 249–266. doi : 10.1099/ijs.0.016949-0 . hdl : 10261/49238 . PMID  19700448.
  11. ^ Meier-Kolthoff JP, Hahnke RL, Petersen JP, Scheuner CS, Michael VM, Fiebig AF, Rohde CR, Rohde MR, Fartmann BF, Goodwin LA, Chertkov OC, Reddy TR, Pati AP, Ivanova NN, Markowitz VM, Kyrpides NC, Woyke TW, Klenk HP, Göker M (2013). "Secuencia completa del genoma de DSM 30083T, la cepa tipo (U5/41T) de Escherichia coli, y una propuesta para delinear subespecies en la taxonomía microbiana". Estándares en Ciencias Genómicas . 9 : 2. doi : 10.1186/1944-3277-9-2 . PMC 4334874 . PMID  25780495. 
  12. ^ Mehlen, André; Goeldner, Marcia; Ried, Sabine; Stindl, Sibylle; Ludwig, Wolfgang; Schleifer, Karl-Heinz (noviembre de 2004). "Desarrollo de un método rápido de hibridación ADN-ADN basado en perfiles de fusión en microplacas". Microbiología sistemática y aplicada . 27 (6): 689–695. doi :10.1078/0723202042369875. ISSN  0723-2020. PMID  15612626.
  13. ^ Huang, Chien-Hsun; Li, Shiao-Wen; Huang, Lina; Watanabe, Koichi (2018). "Identificación y clasificación del grupo Lactobacillus casei". Frontiers in Microbiology . 9 : 1974. doi : 10.3389/fmicb.2018.01974 . ISSN  1664-302X. PMC 6113361 . PMID  30186277. 
  14. ^ Similitudes genéticas: Wilson, Sarich, Sibley y Ahlquist
  15. ^ CG Sibley y JE Ahlquist (1984). "La filogenia de los primates hominoides, según lo indicado por la hibridación ADN-ADN". Journal of Molecular Evolution . 20 (1): 2–15. Bibcode :1984JMolE..20....2S. doi :10.1007/BF02101980. PMID  6429338. S2CID  6658046.
  16. ^ Pardue, Mary Lou y Joseph G Hall. “Hibridación molecular de ADN radiactivo con el ADN de preparaciones citológicas”. Kline Biology Tower, Universidad de Yale, 13 de agosto de 1969.
  17. ^ Marks, Jonathan (9 de mayo de 2007). «Hibridación de ADN en los simios: cuestiones técnicas». Archivado desde el original el 9 de mayo de 2007. Consultado el 2 de junio de 2019 .
  18. ^ SS Socransky; AD Haffajee; C. Smith; L. Martin; JA Haffajee; NG Uzel; JM Goodson (2004). "Uso de hibridación ADN-ADN en tablero de ajedrez para estudiar ecosistemas microbianos complejos". Microbiología e inmunología oral . 19 (6): 352–362. doi :10.1111/j.1399-302x.2004.00168.x. PMID  15491460.
  19. ^ ab Meier-Kolthoff JP, Auch AF, Klenk HP, Goeker M (2013). "Delimitación de especies basada en secuencias genómicas con intervalos de confianza y funciones de distancia mejoradas". BMC Bioinformatics . 14 : 60. doi : 10.1186/1471-2105-14-60 . PMC 3665452 . PMID  23432962. 
  20. ^ Riojas, Marco A.; McGough, Katya J.; Rider-Riojas, Cristin J.; Rastogi, Nalin; Hazbón, Manzour Hernando (1 de enero de 2018). "El análisis filogenómico de las especies del complejo Mycobacterium tuberculosis demuestra que Mycobacterium africanum, Mycobacterium bovis, Mycobacterium caprae, Mycobacterium microti y Mycobacterium pinnipedii son sinónimos heterotípicos posteriores de Mycobacterium tuberculosis". Revista Internacional de Microbiología Sistemática y Evolutiva . 68 (1): 324–332. doi : 10.1099/ijsem.0.002507 . PMID  29205127.
  21. ^ Arahal, David R.; Bull, Carolee T.; Busse, Hans-Jürgen; Christensen, Henrik; Chuvochina, Maria; Dedysh, Svetlana N.; Fournier, Pierre-Edouard; Konstantinidis, Konstantinos T.; Parker, Charles T.; Rossello-Mora, Ramon; Ventosa, Antonio; Göker, Markus (27 de abril de 2023). "Opiniones judiciales 123-127". Revista internacional de microbiología sistemática y evolutiva . 72 (12). doi :10.1099/ijsem.0.005708. hdl : 10261/295959 . PMID  36748499.

Lectura adicional