El complejo de proteína de mantenimiento de minicromosomas ( MCM ) es una helicasa de ADN esencial para la replicación del ADN genómico. El MCM eucariota consta de seis productos génicos, Mcm2–7, que forman un heterohexámero. [1] [2] Como proteína crítica para la división celular, MCM también es el objetivo de varias vías de puntos de control, como los puntos de control de entrada en la fase S y de detención de la fase S. Tanto la carga como la activación de la helicasa MCM están estrictamente reguladas y están acopladas a los ciclos de crecimiento celular. La desregulación de la función de MCM se ha relacionado con la inestabilidad genómica y una variedad de carcinomas. [3] [4]
Las proteínas de mantenimiento de minicromosomas recibieron su nombre a raíz de un análisis genético de levaduras para detectar mutantes defectuosos en la regulación del inicio de la replicación del ADN. [6] La razón de este análisis fue que si los orígenes de replicación se regulaban de manera análoga a los promotores de transcripción, donde los reguladores transcripcionales mostraban especificidad de promotor, entonces los reguladores de replicación también deberían mostrar especificidad de origen. Dado que los cromosomas eucariotas contienen múltiples orígenes de replicación y los plásmidos contienen solo uno, un ligero defecto en estos reguladores tendría un efecto dramático en la replicación de plásmidos pero poco efecto en los cromosomas. En este análisis, se identificaron mutantes condicionales para la pérdida de plásmidos. En un análisis secundario, estos mutantes condicionales se seleccionaron por defectos en el mantenimiento de plásmidos contra una colección de plásmidos, cada uno con una secuencia de origen diferente. Se identificaron dos clases de mutantes mcm : aquellos que afectaban la estabilidad de todos los minicromosomas y otros que afectaban la estabilidad de solo un subconjunto de los minicromosomas. Los primeros eran mutantes defectuosos en la segregación cromosómica, como mcm16, mcm20 y mcm21. Entre la última clase de mutantes de origen específico estaban mcm1, mcm2, mcm3, mcm5 y mcm10. Más tarde, otros identificaron Mcm4, Mcm6 y Mcm7 en levaduras y otros eucariotas basándose en la homología con Mcm2p, Mcm3p y Mcm5p, ampliando la familia MCM a seis, posteriormente conocida como la familia Mcm2-7. [5] En las arqueas, el anillo heterohexámero es reemplazado por un homohexámero formado por una proteína mcm de un solo tipo , lo que apunta a una historia de duplicación y diversificación génica. [7]
Mcm1 [8] [9] y Mcm10 [10] [11] también participan en la replicación del ADN, directa o indirectamente, pero no tienen homología de secuencia con la familia Mcm2-7.
La MCM2-7 es necesaria tanto para la iniciación como para la elongación de la replicación del ADN; su regulación en cada etapa es una característica central de la replicación del ADN eucariota. [3] Durante la fase G1, los dos anillos Mcm2-7 que se encuentran uno frente al otro sirven como andamiaje para el ensamblaje de los complejos de iniciación de la replicación bidireccional en el origen de la replicación. Durante la fase S, el complejo Mcm2-7 forma el núcleo catalítico de la helicasa Cdc45-MCM-GINS, el motor de desenrollado del ADN del replisoma.
La selección del sitio para los orígenes de replicación se lleva a cabo por el complejo de reconocimiento de origen (ORC), un complejo de seis subunidades (Orc1-6). [12] [13] Durante la fase G1 del ciclo celular, Cdc6 es reclutado por ORC para formar una plataforma de lanzamiento para la carga de dos hexámeros Mcm2-7 cabeza con cabeza, también conocido como el complejo de pre-replicación (pre-RC). [14] Existe evidencia genética y bioquímica de que el reclutamiento del doble hexámero puede involucrar uno [15] o dos [16] ORC. El hexámero Mcm2-7 soluble forma una estructura flexible de anillo abierto levógiro estabilizada por Cdt1 antes de su carga en la cromatina, [2] [17] uno a la vez. [18] La estructura del intermediario ORC-Cdc6-Cdt1-MCM (OCCM) formado después de la carga del primer heptámero Cdt1-Mcm2-7 indica que el dominio de hélice alada en las extensiones C-terminales (CTE) del complejo Mcm2-7 se ancla firmemente sobre las superficies creadas por la estructura de anillo ORC-Cdc6 alrededor del ADN de origen. [19] Se cree que la fusión de los dos hexámeros Mcm2-7 cabeza con cabeza se ve facilitada por la eliminación de Cdt1, lo que deja los NTD de los dos hexámeros MCM flexibles para interacciones entre anillos. [20] [1] La carga de MCM2-7 sobre el ADN es un proceso activo que requiere hidrólisis de ATP tanto por Orc1-6 como por Cdc6. [21] Este proceso se denomina "Licencia de replicación", ya que es un prerrequisito para el inicio de la replicación del ADN en cada ciclo de división celular. [22] [23]
En la fase G1 tardía/S temprana, el pre-RC se activa para el desenrollado del ADN por las quinasas dependientes de ciclina (CDK) y DDK. Esto facilita la carga de factores de replicación adicionales (por ejemplo, Cdc45 , MCM10 , GINS y ADN polimerasas ) y el desenrollado del ADN en el origen. [3] Una vez que se completa la formación del pre-RC, Orc1-6 y Cdc6 ya no son necesarios para la retención de MCM2-7 en el origen, y son prescindibles para la replicación posterior del ADN.
Al entrar en la fase S, la actividad de las CDK y de la quinasa dependiente de Dbf4 (DDK) Cdc7 promueve el ensamblaje de las horquillas de replicación , probablemente en parte mediante la activación de MCM2-7 para desenrollar el ADN. Después de la carga de la ADN polimerasa, comienza la replicación bidireccional del ADN.
Durante la fase S, Cdc6 y Cdt1 se degradan o inactivan para bloquear la formación adicional de pre-RC, y se produce la replicación bidireccional del ADN. Cuando la horquilla de replicación encuentra lesiones en el ADN, la respuesta del punto de control de la fase S ralentiza o detiene la progresión de la horquilla y estabiliza la asociación de MCM2-7 con la horquilla de replicación durante la reparación del ADN. [24]
El sistema de licencias de replicación actúa para garantizar que ninguna sección del genoma se replique más de una vez en un solo ciclo celular. [25]
La inactivación de cualquiera de al menos cinco de las seis subunidades MCM durante la fase S bloquea rápidamente la elongación en curso. Como mecanismo crítico para asegurar una única ronda de replicación del ADN, la carga de complejos MCM2-7 adicionales en pre-RC se inactiva por medios redundantes después del paso a la fase S. [26]
La actividad de MCM2-7 también puede regularse durante la elongación. La pérdida de la integridad de la horquilla de replicación, un evento precipitado por daño del ADN, secuencia de ADN inusual o precursores de desoxirribonucleótidos insuficientes, puede conducir a la formación de roturas de doble cadena de ADN y reordenamientos cromosómicos. Normalmente, estos problemas de replicación desencadenan un punto de control de fase S que minimiza el daño genómico al bloquear una mayor elongación y estabilizar físicamente las asociaciones proteína-ADN en la horquilla de replicación hasta que se solucione el problema. Esta estabilización de la horquilla de replicación requiere la interacción física de MCM2-7 con Mrc1, Tof1 y Csm3 (complejo M/T/C). [27] En ausencia de estas proteínas, el desenrollado del dsADN y el movimiento del replisoma impulsados por MCM2-7 continúan, pero la síntesis de ADN se detiene. Al menos parte de esta detención se debe a la disociación de la polimerasa ε de la horquilla de replicación. [27]
Cada subunidad en la estructura de MCM contiene dos grandes dominios N- y C-terminales. El dominio N-terminal consta de tres subdominios pequeños y parece ser utilizado principalmente para la organización estructural. [28] [1] El dominio N puede coordinarse con el dominio AAA + helicasa C-terminal de una subunidad vecina a través de un bucle largo y conservado. [29] [1] Se ha demostrado que este bucle conservado, llamado bucle de control alostérico, desempeña un papel en la regulación de las interacciones entre las regiones N- y C-terminales al facilitar la comunicación entre los dominios en respuesta a la hidrólisis de ATP [10]. El dominio N también establece la direccionalidad 3′→5′ in vitro de MCM. [30] [31]
En cuanto al mecanismo físico de cómo una helicasa hexamérica desenrolla el ADN, se han propuesto dos modelos basados en datos in vivo e in vitro. En el modelo "estérico", la helicasa se transloca firmemente a lo largo de una hebra de ADN mientras desplaza físicamente la hebra complementaria. En el modelo de "bombeo", pares de helicasas hexaméricas desenrollan el ADN dúplex ya sea retorciéndolo o extruyéndolo a través de canales en el complejo.
El modelo estérico plantea la hipótesis de que la helicasa rodea el dsADN y, después de la fusión local del ADN dúplex en el origen, se transloca lejos del origen, arrastrando una "cuña" proteica rígida (ya sea parte de la propia helicasa u otra proteína asociada) que separa las cadenas de ADN. [32]
El modelo de bomba postula que múltiples helicasas se cargan en los orígenes de replicación, se alejan unas de otras y, de alguna manera, terminan ancladas en su lugar. Luego, rotan el dsADN en direcciones opuestas, lo que da como resultado el desenrollado de la doble hélice en la región intermedia. [33] También se ha propuesto que el modelo de bomba se limite a la fusión del ADN de origen mientras los complejos Mcm2-7 todavía están anclados en el origen justo antes del inicio de la replicación. [1]
Se ha demostrado que varios MCM promueven la proliferación celular in vitro e in vivo, especialmente en ciertos tipos de líneas celulares cancerosas. La asociación entre los MCM y la proliferación en líneas celulares cancerosas se atribuye principalmente a su capacidad para mejorar la replicación del ADN. Las funciones de MCM2 y MCM7 en la proliferación celular se han demostrado en varios contextos celulares e incluso en muestras humanas. [26]
Se ha demostrado que MCM2 se expresa con frecuencia en células pulmonares premalignas en proliferación. Su expresión se asoció con células que tienen un mayor potencial de proliferación en el epitelio escamoso no displásico, histiocitomas fibrosos malignos y carcinoma endometrial, mientras que la expresión de MCM2 también se correlacionó con un mayor índice mitótico en muestras de cáncer de mama. [34]
De manera similar, muchos estudios de investigación han demostrado el vínculo entre la expresión de MCM7 y la proliferación celular. La expresión de MCM7 se correlacionó significativamente con la expresión de Ki67 en coriocarcinomas, cáncer de pulmón, neoplasia urotelial papilar, cáncer de esófago y cáncer de endometrio. Su expresión también se asoció con un mayor índice proliferativo en neoplasia intraepitelial prostática y cáncer. [35]