Las sondas de lantánidos son una herramienta analítica no invasiva [1] comúnmente utilizada para aplicaciones biológicas y químicas . Los lantánidos son iones metálicos que tienen su nivel de energía 4f lleno y generalmente se refieren a elementos desde cerio hasta lutecio en la tabla periódica . [2] La fluorescencia de las sales de lantánidos es débil porque la absorción de energía del ion metálico es baja; por lo tanto, los complejos quelados de lantánidos son los más utilizados. [3] El término quelato deriva de la palabra griega que significa “garra” y se aplica para nombrar ligandos, que se unen a un ion metálico con dos o más átomos donantes a través de enlaces dativos . La fluorescencia es más intensa cuando el ion metálico tiene el estado de oxidación 3+. No se pueden utilizar todos los metales lantánidos y los más comunes son: Sm(III), Eu(III), Tb(III) y Dy(III). [3]
Desde principios de la década de 1930 se sabe que las sales de ciertos lantánidos son fluorescentes. [4] La reacción de las sales de lantánido con ácidos nucleicos se analizó en varias publicaciones durante las décadas de 1930 y 1940, donde se empleaban reactivos que contenían lantano para la fijación de estructuras de ácidos nucleicos. [3] En 1942 se descubrió que complejos de europio , terbio y samario exhibían propiedades de luminiscencia inusuales cuando se excitaban con luz ultravioleta . [3] Sin embargo, la primera tinción de células biológicas con lantánidos se produjo veinte años después, cuando se trataron frotis bacterianos de E. coli con soluciones acuosas de un complejo de europio, que bajo la iluminación de una lámpara de mercurio aparecían como puntos rojos brillantes. [1] La atención a las sondas de lantánidos aumentó enormemente a mediados de la década de 1970, cuando investigadores finlandeses propusieron poliaminocarboxilatos de Eu(III), Sm(III), Tb(III) y Dy(III) como sensores luminiscentes en luminiscencia resuelta en el tiempo (TRL). inmunoensayos. [1] La optimización de los métodos analíticos a partir de la década de 1970 para los quelatos de lantánidos y la microscopía de luminiscencia resuelta en el tiempo (TRLM) dio como resultado el uso de sondas de lantánidos en muchos campos científicos, médicos y comerciales. [1]
Hay dos técnicas de ensayo principales: heterogénea y homogénea. Si en el análisis se utilizan dos quelatos de lantánidos uno tras otro, se denomina ensayo heterogéneo. [4] El primer analito se une a un agente aglutinante específico sobre un soporte sólido como un polímero y luego otra reacción acopla el primer complejo de lantánido poco luminiscente con uno nuevo y mejor. [1] [4] Este método tedioso se utiliza porque el segundo compuesto más luminiscente no se uniría sin el primer analito ya presente. La detección posterior resuelta en el tiempo de la sonda luminiscente centrada en metal produce la señal deseada. Los antígenos , los esteroides y las hormonas se analizan habitualmente con técnicas heterogéneas. Los ensayos homogéneos se basan en el acoplamiento directo del marcador de lantánido con un aceptor orgánico. [1]
La relajación de los estados de las moléculas excitadas a menudo se produce mediante la emisión de luz que se denomina fluorescencia. Hay dos formas de medir esta radiación emitida: en función de la frecuencia (inversa a la longitud de onda ) o del tiempo. [4] Convencionalmente, el espectro de fluorescencia muestra la intensidad de la fluorescencia en diferentes longitudes de onda, pero dado que los lantánidos tienen tiempos de caída de la fluorescencia relativamente largos (que van desde un microsegundo a un milisegundo), es posible registrar la emisión de fluorescencia en diferentes tiempos de caída de los dados. energía de excitación en el tiempo cero. Esto se llama espectroscopia de fluorescencia resuelta en el tiempo. [5]
Los lantánidos se pueden utilizar porque su pequeño tamaño ( radio iónico ) les da la capacidad de reemplazar iones metálicos dentro de complejos proteicos como el calcio o el níquel . Las propiedades ópticas de los iones lantánidos como el Ln(III) se originan en las características especiales de sus configuraciones electrónicas [Xe]4f n . [4] Estas configuraciones generan muchos niveles electrónicos, cuyo número viene dado por [14!/n!(14- n)!], lo que se traduce en 3003 niveles de energía para Eu(III) y Tb(III). [1]
Las energías de estos niveles están bien definidas debido al blindaje de los orbitales 4f por las subcapas llenas 5s y 5p, [4] y no son muy sensibles a los entornos químicos en los que se insertan los iones lantánidos. Las transiciones 4f-4f de la capa interna abarcan tanto el rango visible como el infrarrojo cercano. [1] Son nítidos y fácilmente reconocibles. Dado que estas transiciones tienen paridad prohibida, la vida útil de los estados excitados es larga, lo que permite el uso de espectroscopia resuelta en el tiempo , [4] un activo definitivo para bioensayos y microscopía. El único inconveniente de las transiciones ff es la débil potencia de su oscilador, que de hecho puede convertirse en una ventaja. [1]
La energía absorbida por el receptor orgánico (ligando) se transfiere a estados excitados de Ln(III), y se detectan bandas de emisión marcadas que se originan en el ion metálico después de una rápida conversión interna al nivel de emisión. [1] El fenómeno se denomina sensibilización del complejo centrado en el metal (también conocido como efecto antena) y es bastante complejo. [4] Sin embargo, la ruta de migración de energía pasa por el estado triplete de larga duración del ligando. Los iones Ln(III) son buenos desactivadores de estados tripletes, de modo que el fotoblanqueo se reduce sustancialmente. Los tres tipos de transiciones observadas para las sondas de lantánidos son: LMCT, 4f-5d y 4f-4f intraconfiguracional. Los dos primeros suelen producirse a energías demasiado altas para ser relevantes para aplicaciones biológicas. [1] [4]
Las herramientas de detección para el desarrollo de nuevas terapias contra el cáncer tienen una gran demanda en todo el mundo y a menudo requieren la determinación de la cinética enzimática. [1] La alta sensibilidad de la luminiscencia de los lantánidos, particularmente de la luminiscencia resuelta en el tiempo, ha revelado ser un candidato ideal para este propósito. Hay varias formas de realizar este análisis mediante el uso de sustratos de enzimas fluorogénicas, sustratos que contienen grupos donantes/aceptores que permiten la transferencia de energía por resonancia de fluorescencia (FRET) e inmunoensayos. Por ejemplo, las proteínas de unión a nucleótidos de guanina constan de varias subunidades, una de las cuales comprende las de la subfamilia Ras . [1] Las Ras GTPasas actúan como interruptores binarios al convertir el trifosfato de guadenosina ( GTP ) en difosfato de guadenosina ( PIB ). La luminiscencia del complejo Tb(III) con norfloxacino es sensible para determinar la concentración de fosfato liberado por la transformación de GTP en GDP. [1]
La protonación de sitios básicos en sistemas que comprenden un cromóforo y un centro metálico luminiscente abre el camino para los sensores de pH. [4] Algunos sistemas propuestos inicialmente se basaban en derivados de piridina, pero no eran estables en agua. [1] Se han propuesto sensores más robustos en los que el núcleo es un macrociclo sustituido que generalmente lleva grupos coordinadores fosfinato , carboxilato o cuatro amida . Se ha observado que la emisión de la sonda luminiscente de lantánidos aumenta aproximadamente seis veces al disminuir el pH de la solución de seis a dos. [1]
El peróxido de hidrógeno se puede detectar con alta sensibilidad mediante la luminiscencia de las sondas de lantánidos, aunque sólo a valores de pH relativamente altos. En 2002 se propuso un procedimiento analítico basado en lantánidos basándose en el hallazgo de que el complejo de europio con varias tetraciclinas se une al peróxido de hidrógeno formando un complejo luminiscente. [1]
FRET en sondas de lantánidos es una técnica ampliamente utilizada para medir la distancia entre dos puntos separados por aproximadamente 15 a 100 Angstrom. [6] Las mediciones se pueden realizar en condiciones fisiológicas in vitro con colorantes codificados genéticamente y, a menudo, también in vivo. La técnica se basa en una transferencia de energía a distancia desde un fluoróforo donante a un tinte aceptor. Se han utilizado sondas de lantánidos para estudiar las interacciones ADN-proteína (utilizando un complejo de quelato de terbio ) para medir distancias en complejos de ADN doblados por la proteína CAP. [6]
Se han utilizado sondas de lantánidos para detectar cambios conformacionales en proteínas. Recientemente, se midió mediante esta técnica el canal de iones de potasio Shaker , [6], un canal dependiente de voltaje implicado en los impulsos nerviosos. [7] Algunos científicos también han utilizado la transferencia de energía por resonancia de luminiscencia (LRET) basada en lantánidos, que es muy similar a FRET para estudiar los cambios conformacionales en la ARN polimerasa al unirse al ADN y el inicio de la transcripción en procariotas. LRET también se utilizó para estudiar la interacción de las proteínas distrofina y actina en las células musculares. La distrofina está presente en la membrana interna de las células musculares y se cree que estabiliza las fibras musculares uniéndose a los filamentos de actina. Se utilizaron distrofina marcada específicamente con anticuerpos monoclonales marcados con Tb. [6]
Los procedimientos tradicionales de diagnóstico de virus están siendo reemplazados por inmunoensayos sensibles con lantánidos. La técnica basada en fluorescencia de resolución temporal es generalmente aplicable y su rendimiento también se ha probado en el ensayo de antígenos virales en muestras clínicas. [6]
Se han propuesto varios sistemas que combinan la capacidad de resonancia magnética con sondas de lantánidos en ensayos duales. [4] La sonda luminiscente puede servir, por ejemplo, para localizar el agente de contraste de MRI. [8] Esto ha ayudado a visualizar la entrega de ácidos nucleicos en células cultivadas. Los lantánidos no se utilizan por su fluorescencia sino por sus cualidades magnéticas. [8] [9]
Las sondas de lantánidos muestran propiedades de fluorescencia únicas, incluida una larga vida útil de la fluorescencia, un gran desplazamiento de Stokes y un pico de emisión estrecho. Estas propiedades son muy ventajosas para desarrollar sondas analíticas para interacciones receptor-ligando. Se han desarrollado muchos estudios de fluorescencia basados en lantánidos para GPCR , incluido CXCR1 , [10] receptor 2 de péptidos similares a la insulina, [11] receptor 2 activado por proteasa , [12] receptor β2-adrenérgico [13] y receptor C3a . [14]
Los fotones emitidos por los lantánidos excitados se detectan mediante dispositivos y técnicas altamente sensibles, como la detección de fotón único. Si la vida útil del nivel de emisión excitado es lo suficientemente larga, entonces se puede utilizar la detección resuelta en el tiempo (TRD) para mejorar la relación señal-ruido. [5] La instrumentación utilizada para realizar LRET es relativamente simple, aunque un poco más compleja que los fluorímetros convencionales. Los requisitos generales son una fuente de excitación UV pulsada y una detección resuelta en el tiempo.
Las fuentes de luz que emiten pulsos de corta duración se pueden dividir en las siguientes categorías: [3]
Los factores más importantes en la selección de la fuente de luz pulsada son la duración y la intensidad de la luz. [3] Los láseres pulsados para el rango de 300 a 500 nm ahora han reemplazado a las chispas en la espectroscopia de fluorescencia. Se utilizan cuatro tipos generales de láseres pulsantes: láseres con excitación pulsada, láseres con conmutación G, láseres de modo bloqueado y láseres de cavidad volcada. Los láseres de nitrógeno pulsados (337 nm) se han utilizado a menudo como fuente de excitación en fluorometría de resolución temporal. [3]
En la fluorometría resuelta en el tiempo, el tubo fotomultiplicador rápido es el único detector práctico de fotón único. Una buena resolución de fotón único también es una ventaja al contar fotones de sondas fluorescentes de desintegración prolongada, como los quelatos de lantánidos. [4]
Estos instrumentos comerciales están disponibles en el mercado hoy en día: fluorómetro con microfiltro Perkin-Elmer LS-2, espectrómetro de luminiscencia Perkin-Elmer modelo LS 5 y fluorómetro de resolución temporal LKB-Wallac modelo 1230. [3]
Los ligandos de las sondas de lantánidos deben cumplir varios requisitos químicos para que las sondas funcionen correctamente. Estas cualidades son: solubilidad en agua, gran estabilidad termodinámica a pH fisiológicos , inercia cinética y absorción por encima de 330 nm para minimizar la destrucción de materiales biológicos vivos. [1]
Los quelatos que se han estudiado y utilizado hasta la fecha se pueden clasificar en los siguientes grupos: [3]
La eficiencia de la transferencia de energía del ligando al ion se determina por el enlace ligando-metal. La transferencia de energía es más eficiente cuando se unen covalentemente que mediante enlaces iónicos. [15] Los sustituyentes en el ligando que son donadores de electrones, como los grupos hidroxi , metoxi y metilo, aumentan la fluorescencia. [3] El efecto opuesto se observa cuando se une un grupo aceptor de electrones (como el nitro). [3] [4] Además, la intensidad de la fluorescencia aumenta mediante la sustitución de flúor en el ligando. La transferencia de energía al ion metálico aumenta a medida que la electronegatividad del grupo fluorado hace que el enlace europio-oxígeno sea de naturaleza más covalente. Se ha demostrado que el aumento de la conjugación mediante sustituyentes aromáticos mediante la sustitución de grupos fenilo por grupos naftilo mejora la fluorescencia. [15]
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