Las pruebas musculares in vitro son un método utilizado para caracterizar las propiedades del tejido muscular vivo después de extraerlo de un organismo, lo que permite una cuantificación más extensa y precisa de sus propiedades que las pruebas in vivo . Las pruebas musculares in vitro han proporcionado la mayor parte del conocimiento científico sobre la estructura y fisiología muscular, y cómo ambas se relacionan con el rendimiento del organismo. La investigación con células madre se basa en pruebas musculares in vitro para establecer la función de las células musculares únicas y su comportamiento individual, aparte de las células musculares en presencia de células no musculares observadas en estudios in vitro . [1]
Una vez que se ha seleccionado un animal apropiado, ya sea para una función locomotora específica (por ejemplo, ranas para saltar); o una cepa animal específica, para responder a una pregunta de investigación: se identifica un músculo específico en función de su función in vivo y la distribución del tipo de fibra. Tras la aprobación ética y, si es necesario, la aprobación del gobierno, el animal es sacrificado humanamente. Los métodos humanos difieren según el país; los más apropiados se basan en la aprobación ética y el nivel de habilidad del investigador. Se deben seguir una serie de criterios adicionales para garantizar que el animal esté completamente muerto sin posibilidad de recuperación, que incluyen el cese del flujo sanguíneo mediante la extracción del corazón del sistema circulatorio y/o la destrucción completa del cerebro y la columna vertebral. Después de esto, generalmente se obtienen rápidamente medidas comunes de la morfología animal, como la longitud del animal, la masa corporal y otros marcadores biomecánicos que pueden ser de importancia. Luego se prepara al animal para la extracción del músculo objetivo. En músculos aislados, estos tienden a ser músculos de las extremidades posteriores, como el sóleo o EDL de los mamíferos, o el plantar o iliotibial de los anfibios. Otros músculos que se han examinado in vitro incluyen el diafragma y el músculo papilar .
Para el aislamiento exitoso de los músculos esqueléticos se requieren condiciones específicas. El tejido debe aislarse en una solución de Ringer enfriada y cambiada con frecuencia o en una solución de Krebs-Henseleit para garantizar que las condiciones metabólicas se reduzcan, de ahí la necesidad de un medio de disección enfriado, y para evitar que el tejido muera debido a la falta de sustratos dentro del medio, por lo tanto. el requisito de que las soluciones se cambien con frecuencia. La solución de disección debe oxigenarse continuamente con la concentración adecuada de oxígeno y dióxido de carbono para el tejido que se está preparando. Normalmente, los tejidos de no mamíferos se preparan en una solución gaseosa a la que se le burbujea un 98% de oxígeno y un 2% de dióxido de carbono, mientras que los tejidos de mamíferos se preparan en una solución a la que se le burbujea un 95% de oxígeno y un 5% de dióxido de carbono. Se requiere un microscopio con un nivel de aumento adecuado debido a la destreza necesaria para aislar los músculos. Una fuente de luz externa de fibra óptica también es beneficiosa para proporcionar suficiente luz sin emisión de calor.
No existe un enfoque correcto para la preparación de los músculos para la prueba, siempre y cuando el músculo no se dañe durante la preparación, la unidad músculo-tendón esté intacta y haya algo que pueda usarse para anclar el músculo dentro del equipo de prueba. Se pueden dejar trozos de hueso en el extremo proximal y/o distal de los músculos esqueléticos para permitir el anclaje. Además, se pueden usar suturas de seda o clips de lámina en T de aluminio para envolver el tendón del músculo para brindar soporte al tendón y para anclarlo en la plataforma mecánica.
Las pruebas musculares in vitro normalmente requieren un servomotor de modo dual, que puede controlar y detectar cambios en fuerza y longitud. Si no se dispone de un sistema de modo dual, se puede utilizar un transductor de fuerza independiente y un brazo motor. Un extremo del tejido de la muestra se ancla en su lugar, mediante una aguja si está suturada o una pinza de cocodrilo si se prepara con clips en forma de T de aluminio, mientras que el otro extremo se fija al servomotor. Todo el músculo se baña en solución de Ringer o solución de Krebs-Henseleit con oxígeno burbujeando para mantener el tejido vivo y metabólicamente activo. La solución se calienta, normalmente a través de un baño de agua calentador/enfriador externo, hasta una temperatura de prueba adecuada para el músculo que se está examinando. Se estimula la contracción de los músculos aplicando corriente eléctrica al nervio que inerva el músculo o mediante electrodos de platino colocados en la solución circulante para provocar una respuesta de todo el músculo. El servomotor detecta cambios de fuerza y/o longitud debido a la contracción muscular . El nivel de estimulación a menudo se establece en el nivel que garantiza el máximo reclutamiento de unidades motoras . El servomotor se puede programar para mantener una fuerza determinada mientras se permite que el músculo cambie de longitud, y viceversa, o el músculo puede estar sujeto a pruebas más complejas, como en bucles de trabajo . Cuando se utilizan músculos penados , a menudo se utiliza la sonomicrometría para determinar con precisión la longitud de las fibras durante la prueba.
Las pruebas musculares in vitro se pueden realizar en cualquier escala de organización muscular: grupos enteros de músculos (siempre que compartan una inserción u origen común, como en el cuádriceps humano), un solo músculo, un "haz" de fibras musculares , un solo músculo. fibra, una sola miofibrilla, un solo sarcómero , un cardiomiocito o incluso un medio sarcómero. Las fibras musculares pueden estar intactas o pueden estar "despellejadas", un proceso que elimina la membrana celular, el retículo sarcoplásmico y el citoplasma, lo que permite un mayor acceso a los componentes contráctiles del sarcómero.
Comúnmente se prueban varias propiedades, y un experimento determinado a menudo utilizará un subconjunto de estas propiedades, incluidos los tiempos de contracción, la fuerza tetánica, la relación fuerza-longitud, la relación fuerza-velocidad, los bucles de trabajo , las pruebas de fatiga, la frecuencia de fusión y el costo energético.
Recientemente se ha utilizado un enfoque híbrido entre in vitro e in vivo , llamado in situ , en el que se somete al organismo a anestesia terminal y se realizan pruebas in vivo con el músculo aún adherido al organismo. Esto garantiza que el músculo se mantenga a la temperatura adecuada y que la sangre le proporcione abundantes nutrientes y oxígeno, pero el procedimiento es más difícil y es posible que algunas pruebas no sean posibles. [2]
Las pruebas musculares in vitro casi nunca se utilizan en humanos, con la excepción de pequeñas secciones de músculo extraídas mediante biopsia o durante una cirugía por otras dolencias. Las pruebas son generalmente más difíciles en mamíferos y aves debido a la alta temperatura y los requisitos de oxígeno del músculo, lo que lleva a una rápida muerte celular una vez que el tejido muscular se elimina del organismo. Los músculos esqueléticos de los mamíferos se prueban habitualmente a ~25°C para prolongar el protocolo de prueba el mayor tiempo posible. También se puede utilizar una temperatura de prueba de ~37°C durante la prueba de músculos esqueléticos de mamíferos aislados completos para replicar mejor la temperatura encontrada in vivo . Además, es importante considerar la especialización térmica de los músculos esqueléticos, siendo los músculos centrales más susceptibles a cambios en el rendimiento mecánico con pequeños cambios de temperatura que los músculos periféricos. [3] En los ectotermos (reptiles, anfibios, peces e invertebrados), el tejido muscular puede sobrevivir fuera del organismo durante horas o incluso días, dependiendo de la temperatura y el organismo. Muchos experimentos se llevan a cabo a 0°C o cerca de ella para prolongar la vida útil del músculo. Además, en peces y anfibios, es posible separar una sola fibra muscular manteniéndola intacta, pero en otras especies esto generalmente no es posible.
El aislamiento del tejido muscular in vitro permite obtener datos individuales de la función de las células musculares sin la presencia de células no musculares de señalización cercanas. [1] Las pruebas in vitro permiten la estimulación exacta del músculo, proporcionando datos precisos sobre el comportamiento innato del tejido. [4] Las pruebas de músculos aislados limitan otros factores en el entorno alrededor del tejido, como los sustratos. La prueba de músculos aislados in vitro es un procedimiento beneficioso basado en su exactitud, precisión y reproducibilidad ideales. [5]
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