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Fok I

La endonucleasa de restricción Fok 1 , que se encuentra de forma natural en Flavobacterium okeanokoites , es una endonucleasa de restricción bacteriana de tipo IIS que consta de un dominio de unión al ADN N-terminal y un dominio de escisión del ADN no específico de la secuencia en el C-terminal . [2] Una vez que la proteína se une al ADN dúplex a través de su dominio de unión al ADN en el sitio de reconocimiento 5'-GGATG-3' , el dominio de escisión del ADN se activa y escinde el ADN en dos ubicaciones, independientemente de la secuencia de nucleótidos en el sitio de corte. El ADN se corta 9 nucleótidos aguas abajo del motivo en la cadena delantera y 13 nucleótidos aguas abajo del motivo en la cadena inversa, [3] produciendo dos extremos pegajosos con salientes de 4 pb.

Su masa molecular es de 65,4 kDa, estando compuesta por 587 aminoácidos.

Dominio de unión al ADN

El dominio de reconocimiento contiene tres subdominios (D1, D2 y D3) que están relacionados evolutivamente con el dominio de unión al ADN de la proteína activadora del gen catabolito que contiene una hélice-giro-hélice. [3]

Dominio de escisión del ADN

La escisión del ADN está mediada por el dominio de escisión no específico que también incluye la superficie de dimerización. [4] La interfaz del dímero está formada por las hélices paralelas α4 y α5 y dos bucles P1 y P2 del dominio de escisión. [3]

Actividad

Cuando la nucleasa no está unida al ADN, el dominio de endonucleasa es secuestrado por el dominio de unión al ADN y se libera a través de un cambio conformacional en el dominio de unión al ADN al unirse a su sitio de reconocimiento. La escisión solo ocurre tras la dimerización, cuando el dominio de reconocimiento está unido a su sitio cognado y en presencia de iones de magnesio. [4]

Explotación

El dominio endonucleasa de Fok1 se ha utilizado en varios estudios, después de la combinación con una variedad de dominios de unión al ADN, como el dedo de zinc (ver nucleasa de dedo de zinc ), [2] o Cas9 inactivo [5] [6] [7]

Una de varias variantes del gen del receptor de vitamina D humano es causada por un polimorfismo de un solo nucleótido en el codón de inicio del gen que se puede distinguir mediante el uso de la enzima Fok1. [8]

Referencias

  1. ^ Aggarwal, AK; Wah, DA; Hirsch, JA; Dorner, LF; Schildkraut, I. (1997). "Estructura de la endonucleasa multimodular Fok1 unida al ADN". Nature . 388 (6637): 97–100. doi :10.1038/40446. PMID  9214510. S2CID  205027830.
  2. ^ ab Durai S, Mani M, Kandavelou K, Wu J, Porteus M, Chandrasegaran S (2005). "Nucleasas de dedos de cinc: tijeras moleculares diseñadas a medida para la ingeniería genómica de células vegetales y mamíferas". Nucleic Acids Res . 33 (18): 5978–90. doi :10.1093/nar/gki912. PMC 1270952 . PMID  16251401. 
  3. ^ abc Wah, DA; Bitinaite, J.; Schildkraut, I.; Aggarwal, AK (1998). "La estructura de Fok1 tiene implicaciones para la escisión del ADN". Proc Natl Acad Sci USA . 95 (18): 10564–9. Bibcode :1998PNAS...9510564W. doi : 10.1073/pnas.95.18.10564 . PMC 27934 . PMID  9724743. 
  4. ^ ab Bitinaite, J.; Wah, DA; Aggarwal, AK; Schildkraut, I. (1998). "La dimerización de Fok1 es necesaria para la escisión del ADN". Proc Natl Acad Sci USA . 95 (18): 10570–5. Bibcode :1998PNAS...9510570B. doi : 10.1073/pnas.95.18.10570 . PMC 27935 . PMID  9724744. 
  5. ^ Tsai, SQ et al. (2014). Nucleasas Fok1 guiadas por ARN CRISPR diméricas para edición genómica altamente específica. Nature Biotechnol. 32, 569–576 doi :10.1038/nbt.2908
  6. ^ Guilinger, JP, Thompson, DB y Liu, DR (2014). La fusión de la nucleasa catalíticamente inactiva Cas9 con Fok1 mejora la especificidad de la modificación del genoma. Nature Biotechnol. 32, 577–582 doi :10.1038/nbt.2909
  7. ^ Wyvekens, N., Topkar, VV, Khayter, C., Joung, JK y Tsai, SQ (2015). Nucleasas Fok1-dCas9 guiadas por ARN CRISPR diméricas dirigidas por ARNm truncados para edición genómica altamente específica. Hum. Gene Ther. 26, 425–431 doi :10.1089/hum.2015.084
  8. ^ Strandberg, S.; et al. (2003). "El polimorfismo del codón de inicio del receptor de vitamina D (Fok1) está relacionado con la densidad mineral ósea en adolescentes varones sanos". J Bone Miner Metab . 21 (2): 109–13. doi :10.1007/s007740300018. PMID  12601576. S2CID  22436824.

Véase también