Etiqueta activadora de fluorescencia y desplazamiento de absorción

Etiqueta de proteína

FAST ( Etiqueta de activación de fluorescencia y cambio de absorción ) es una pequeña etiqueta proteica codificada genéticamente que permite la notificación de fluorescencia de proteínas de interés. A diferencia de las proteínas fluorescentes naturales y sus derivados como GFP o mCherry, FAST no es fluorescente por sí solo. Puede unirse selectivamente a un cromóforo fluorogénico derivado de 4-hidroxibenciliden rodanina (HBR), que en sí mismo no es fluorescente a menos que esté unido. Una vez unidas, el par de moléculas pasa por un mecanismo único de activación de fluorógeno basado en dos cambios espectroscópicos, el aumento del rendimiento cuántico de fluorescencia y el desplazamiento al rojo de la absorción, lo que proporciona una alta selectividad de etiquetado. El sistema de informes FAST-fluorógeno se puede utilizar en microscopía de fluorescencia, citometría de flujo y cualquier otro método fluorométrico para explorar el mundo vivo: biosensores, tráfico de proteínas.

FAST, una pequeña proteína de 14 kDa, se diseñó a partir de la proteína amarilla fotoactiva (PYP) mediante evolución dirigida. Fue informado por primera vez en 2016 por investigadores de la Escuela Normal Superior de París . ^[1]

Mecanismo

FAST pertenece a una estrategia químico-genética para el etiquetado específico de proteínas. Un dominio peptídico, denominado "tag", está codificado genéticamente para unirse a una proteína de interés (mediante combinación de sus respectivos genes mediante transfección o infección). Esta etiqueta es el ancla para una sonda fluorescente sintética que se agregará más adelante. ^[2] Este enfoque químico-genético ya se implementó, además de las proteínas fluorescentes naturales como GFP o sus derivados como mCherry, en varios sistemas ya ampliamente utilizados:

• desde 2003, SNAP-tag , un sistema de notificación de dos componentes que consiste en un péptido de 19 kDa derivado de una enzima humana, O ⁶ -metilguanina-ADN metiltransferasa, evolucionó para formar enlaces covalentes con derivados fluorescentes de O ⁶ -bencilguanina; Posteriormente, la etiqueta SNAP evolucionó hasta convertirse en una etiqueta ortogonal, CLIP-tag ;
• desde 2008, HaloTag , un sistema de notificación de dos componentes que consiste en un péptido de 33 kDa derivado de una enzima bacteriana, una haloalcano deshalogenasa, que puede unirse específicamente a ligandos sintéticos halogenados funcionales, con mayor frecuencia fluorescentes para imágenes celulares ( p. ej. , Coumarine, Oregon Green, Alexa Flúor 488, diAcFAM, TMR).

Unión reversible entre FAST y un fluorógeno

Se han descrito varias versiones de FAST que se diferencian por una pequeña cantidad de mutaciones, por ejemplo , FAST1 (también conocido como Y-FAST), FAST2 (también conocido como iFAST) o un dímero, td-FAST. ^[3] Además, se desarrolló una versión dividida de complementación para monitorear las interacciones proteína-proteína, splitFAST. ^[4] Varios plásmidos que muestran genes FAST o splitFAST están disponibles en Addgene. ^[5]

Aplicaciones

El sistema de informes FAST-fluorógeno se utiliza en microscopía de fluorescencia , citometría de flujo y cualquier otro método fluorométrico para explorar el mundo vivo, incluidos los biosensores y el tráfico de proteínas . Se ha informado que FAST permite obtener imágenes dinámicas de biopelículas debido a su capacidad única de fluorescencia en condiciones de bajo oxígeno. ^[6] Por la misma razón, permite obtener imágenes y realizar FACS anaerobios, como Clostridium , utilizados para la fermentación de biomasa como la fermentación ABE . ^[7] También se ha informado sobre FAST para microscopía de súper resolución de células vivas. ^[8]

The Twinkle Factory desarrolló varios fluorógenos para FAST y sus derivados, que varían según su longitud de onda de emisión, su brillo y su afinidad con las etiquetas. Algunos no son permeables, es decir , no pueden atravesar las membranas celulares, por lo que marcan específicamente proteínas de membrana o proteínas extracelulares, lo que permite, por ejemplo , monitorear el tráfico desde la síntesis hasta la excreción. ^[9]

Referencias

1. Plamont, Marie-Aude; Billon-Denis, Emmanuelle; Maurín, Sylvie; Gaurón, Carole; Pimenta, Federico M.; Specht, Christian G.; Shi, Jian; Quérard, Jérôme; Pan, Buyán; Rossignol, Julien; Moncoq, Karine (28 de diciembre de 2015). "Pequeña etiqueta que activa la fluorescencia y cambia la absorción para obtener imágenes de proteínas sintonizables in vivo". Procedimientos de la Academia Nacional de Ciencias . 113 (3): 497–502. doi : 10.1073/pnas.1513094113 . ISSN  0027-8424. PMC  4725535 . PMID  26711992.
2. Plamont, Marie-Aude; Billon-Denis, Emmanuelle; Maurín, Sylvie; Gaurón, Carole; Pimenta, Federico M.; Specht, Christian G.; Shi, Jian; Quérard, Jérôme; Pan, Buyán; Rossignol, Julien; Moncoq, Karine (19 de enero de 2016). "Pequeña etiqueta que activa la fluorescencia y cambia la absorción para obtener imágenes de proteínas sintonizables in vivo". Procedimientos de la Academia Nacional de Ciencias . 113 (3): 497–502. Código Bib : 2016PNAS..113..497P. doi : 10.1073/pnas.1513094113 . ISSN  0027-8424. PMC 4725535 . PMID  26711992. 
3. Tebo, Alison G.; Pimenta, Federico M.; Zhang, Yu; Gautier, Arnaud (2 de octubre de 2018). "Marcadores fluorescentes químico-genéticos mejorados para microscopía de células vivas" (PDF) . Bioquímica . 57 (39): 5648–5653. doi : 10.1021/acs.biochem.8b00649. ISSN  0006-2960. PMID  30204425. S2CID  52189156.
4. Tebo, Alison G.; Gautier, Arnaud (14 de agosto de 2019). "Corrección del autor: un reportero fluorescente dividido con complementación rápida y reversible". Comunicaciones de la naturaleza . 10 (1): 3730. Código bibliográfico : 2019NatCo..10.3730T. doi : 10.1038/s41467-019-11689-6 . ISSN  2041-1723. PMC 6694131 . PMID  31413330. 
5. "Addgene: plásmidos del laboratorio Arnaud Gautier". www.addgene.org . Consultado el 25 de noviembre de 2019 .
6. Monmeyran, Amaury; Thomen, Philippe; Jonquiere, Hugo; Sureau, Franck; Li, Chengé; Plamont, Marie-Aude; Douarche, Carine; Casella, Jean-François; Gautier, Arnaud; Henry, Nelly (9 de julio de 2018). "El marcador fluorescente químico-genético inducible FAST supera a las proteínas fluorescentes clásicas en el informe cuantitativo de la dinámica de biopelículas bacterianas". Informes científicos . 8 (1): 10336. Código bibliográfico : 2018NatSR...810336M. doi : 10.1038/s41598-018-28643-z . ISSN  2045-2322. PMC 6037777 . PMID  29985417. 
7. Charubino, Kamil; Bennett, R. Kyle; Rápido, Alan G.; Papoutsakis, Eleftherios T. (noviembre de 2018). "Ingeniería de organismos Clostridium como fábricas de células microbianas: desafíos y oportunidades". Ingeniería Metabólica . 50 : 173-191. doi : 10.1016/j.ymben.2018.07.012 . ISSN  1096-7176. PMID  30055325.
8. Venkatachalapatía, Muthukumaran; Belapurkar, Vivek; José, Mini; Gautier, Arnaud; Nair, Deepak (2019). "Imágenes de superresolución de células vivas mediante fluctuaciones radiales utilizando etiquetas de unión de fluorógeno". Nanoescala . 11 (8): 3626–3632. doi :10.1039/c8nr07809b. ISSN  2040-3364. PMID  30734810. S2CID  73450884.
9. Li, Chengé; Mourton, Aurélien; Plamont, Marie-Aude; Rodríguez, Vanessa; Aujard, Isabelle; Volovitch, Michel; Le Saux, Thomas; Pérez, Franck; Vriz, Sofía; Jullien, Ludovico; Joliot, Alain (20 de junio de 2018). "Sondeo fluorogénico del tráfico de proteínas de membrana" (PDF) . Química de bioconjugados . 29 (6): 1823–1828. doi :10.1021/acs.bioconjchem.8b00180. ISSN  1043-1802. PMID  29791141.