La espectroscopia de resonancia magnética nuclear bidimensional ( RMN 2D ) es un conjunto de métodos de espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) que proporcionan datos trazados en un espacio definido por dos ejes de frecuencia en lugar de uno. Los tipos de RMN 2D incluyen espectroscopia de correlación (COSY), espectroscopia J , espectroscopia de intercambio (EXSY) y espectroscopia de efecto Overhauser nuclear (NOESY). Los espectros de RMN bidimensionales proporcionan más información sobre una molécula que los espectros de RMN unidimensionales y son especialmente útiles para determinar la estructura de una molécula , particularmente para moléculas con las que es demasiado complicado trabajar usando RMN unidimensional.
El primer experimento bidimensional, COSY, fue propuesto por Jean Jeener , profesor de la Universidad Libre de Bruselas, en 1971. Este experimento fue implementado posteriormente por Walter P. Aue, Enrico Bartholdi y Richard R. Ernst , quienes publicaron su trabajo. en 1976. [1] [2] [3]
Cada experimento consta de una secuencia de pulsos de radiofrecuencia (RF) con períodos de retraso entre ellos. El tiempo, las frecuencias y las intensidades de estos pulsos distinguen los diferentes experimentos de RMN entre sí. [4] Casi todos los experimentos bidimensionales tienen cuatro etapas: el período de preparación, donde se crea una coherencia de magnetización a través de un conjunto de pulsos de RF; el período de evolución, un período de tiempo determinado durante el cual no se envían pulsos y se permite que los espines nucleares precesen (roten) libremente; el período de mezcla, donde la coherencia es manipulada por otra serie de pulsos hasta un estado que dará una señal observable; y el período de detección, en el que la señal de caída de inducción libre de la muestra se observa en función del tiempo, de una manera idéntica a la FT-NMR unidimensional. [5]
Las dos dimensiones de un experimento de RMN bidimensional son dos ejes de frecuencia que representan un cambio químico. Cada eje de frecuencia está asociado a una de las dos variables de tiempo, que son la duración del período de evolución (el tiempo de evolución ) y el tiempo transcurrido durante el período de detección (el tiempo de detección ). Cada uno de ellos se convierte de una serie de tiempo a una serie de frecuencia mediante una transformada de Fourier bidimensional . Un único experimento bidimensional se genera como una serie de experimentos unidimensionales, con un tiempo de evolución específico diferente en experimentos sucesivos, registrándose en cada experimento toda la duración del período de detección. [5]
El resultado final es un gráfico que muestra un valor de intensidad para cada par de variables de frecuencia. Las intensidades de los picos del espectro se pueden representar mediante una tercera dimensión. Más comúnmente, la intensidad se indica mediante líneas de contorno o diferentes colores.
En estos métodos, la transferencia de magnetización se produce entre núcleos del mismo tipo, mediante acoplamiento en J de núcleos conectados por hasta unos pocos enlaces.
El primer y más popular experimento de RMN bidimensional es la secuencia de espectroscopia de correlación homonuclear (COSY), que se utiliza para identificar espines acoplados entre sí. Consta de un único pulso de RF (p1) seguido del tiempo de evolución específico (t1) seguido de un segundo pulso (p2) seguido de un período de medición (t2). [6]
El espectro bidimensional resultante del experimento COZY muestra las frecuencias de un solo isótopo , más comúnmente hidrógeno ( 1 H) a lo largo de ambos ejes. (También se han ideado técnicas para generar espectros de correlación heteronuclear, en los que los dos ejes corresponden a diferentes isótopos, como 13 C y 1 H). Los picos diagonales corresponden a los picos en un experimento de RMN 1D, mientras que los picos cruzados indican acoplamientos. entre pares de núcleos (al igual que la división multiplete indica acoplamientos en 1D-NMR). [6]
Los picos cruzados resultan de un fenómeno llamado transferencia de magnetización , y su presencia indica que dos núcleos están acoplados y tienen dos desplazamientos químicos diferentes que conforman las coordenadas del pico cruzado. Cada acoplamiento da dos picos cruzados simétricos por encima y por debajo de la diagonal. Es decir, se produce un pico cruzado cuando existe una correlación entre las señales del espectro a lo largo de cada uno de los dos ejes en estos valores. Una forma visual sencilla de determinar qué acoplamientos representa un pico transversal es encontrar el pico diagonal que está directamente encima o debajo del pico transversal, y el otro pico diagonal que está directamente a la izquierda o derecha del pico transversal. Los núcleos representados por esos dos picos diagonales están acoplados. [6]
COSY-90 es el experimento COSY más común. En COSY-90, el pulso p1 inclina el espín nuclear 90°. Otro miembro de la familia COSY es COSY-45 . En COSY-45 se utiliza un pulso de 45° en lugar de un pulso de 90° para el segundo pulso, p2. La ventaja de un COSY-45 es que los picos diagonales son menos pronunciados, lo que hace que sea más sencillo hacer coincidir los picos cruzados cerca de la diagonal en una molécula grande. Además, los signos relativos de las constantes de acoplamiento (ver Acoplamiento en J#Magnitud del acoplamiento en J ) se pueden dilucidar a partir de un espectro COSY-45. Esto no es posible usando COSY-90. [7] En general, el COSY-45 ofrece un espectro más limpio, mientras que el COSY-90 es más sensible.
Otra técnica COSY relacionada es COSY con doble filtrado cuántico (DQF). DQF COZY utiliza un método de selección de coherencia, como el ciclo de fase o los gradientes de campo pulsado , que provocan que solo las señales de coherencias cuánticas dobles proporcionen una señal observable. Esto tiene el efecto de disminuir la intensidad de los picos diagonales y cambiar su forma de línea de una forma de línea amplia de "dispersión" a una forma de línea de "absorción" más nítida. También elimina los picos diagonales de los núcleos desacoplados. Todos estos tienen la ventaja de que proporcionan un espectro más limpio en el que se evita que los picos diagonales oscurezcan los picos cruzados, que son más débiles en un espectro COSY normal. [8]
El experimento TOCSY es similar al experimento COZY, en el sentido de que se observan picos cruzados de protones acoplados. Sin embargo, se observan picos cruzados no sólo para núcleos que están directamente acoplados, sino también entre núcleos que están conectados por una cadena de acoplamientos. Esto lo hace útil para identificar las redes interconectadas más grandes de acoplamientos de espín. Esta capacidad se logra insertando una serie repetitiva de pulsos que provocan una mezcla isotrópica durante el período de mezcla. Tiempos de mezcla isotrópicos más prolongados hacen que la polarización se extienda a través de un número cada vez mayor de enlaces. [9]
En el caso de los oligosacáridos, cada residuo de azúcar es un sistema de espín aislado, por lo que es posible diferenciar todos los protones de un residuo de azúcar específico. También está disponible una versión 1D de TOCSY, y al irradiar un solo protón se puede revelar el resto del sistema de espín. Los avances recientes en esta técnica incluyen el experimento TOCSY 1D-CSSF (filtro selectivo de desplazamiento químico), que produce espectros de mayor calidad y permite extraer y utilizar de manera confiable constantes de acoplamiento para ayudar a determinar la estereoquímica.
TOCSY a veces se denomina "espectroscopia homonuclear de Hartmann-Hahn" (HOHAHA). [10]
INADECUADO [11] es un método que se utiliza a menudo para encontrar acoplamientos de 13 C entre átomos de carbono adyacentes. Debido a que la abundancia natural de 13 C es sólo alrededor del 1%, sólo alrededor del 0,01% de las moléculas que se estudian tendrán los dos átomos de 13 C cercanos necesarios para una señal en este experimento. Sin embargo, se utilizan métodos de selección de correlación (de manera similar a DQF COSY) para evitar señales de átomos de 13 C individuales, de modo que las señales dobles de 13 C se puedan resolver fácilmente. Cada par de núcleos acoplados da un par de picos en el espectro INADECUADO y ambos tienen la misma coordenada vertical, que es la suma de los desplazamientos químicos de los núcleos; la coordenada horizontal de cada pico es el desplazamiento químico para cada uno de los núcleos por separado. [12]
La espectroscopia de correlación heteronuclear proporciona una señal basada en el acoplamiento entre núcleos de dos tipos diferentes. A menudo, los dos núcleos son protones y otro núcleo (llamado "heteronúcleo"). Por razones históricas, los experimentos que registran el espectro del protón en lugar del heteronúcleo durante el período de detección se denominan experimentos "inversos". Esto se debe a que la baja abundancia natural de la mayoría de los heteronúcleos daría como resultado que el espectro de protones se viera abrumado por señales de moléculas sin heteronúcleos activos, lo que lo haría inútil para observar las señales acopladas deseadas. Con la llegada de técnicas para suprimir estas señales no deseadas, los experimentos de correlación inversa como HSQC, HMQC y HMBC son mucho más comunes en la actualidad. La espectroscopia de correlación heteronuclear "normal", en la que se registra el espectro de los heteronúcleos, se conoce como HETCOR. [13]
HSQC detecta correlaciones entre núcleos de dos tipos diferentes que están separados por un enlace. Este método da un pico por par de núcleos acoplados, cuyas dos coordenadas son los desplazamientos químicos de los dos átomos acoplados. [15]
HSQC funciona transfiriendo magnetización desde el núcleo I (generalmente el protón) al núcleo S (generalmente el heteroátomo) usando la secuencia de pulsos INEPT ; Este primer paso se realiza porque el protón tiene una mayor magnetización de equilibrio y, por lo tanto, este paso crea una señal más fuerte. Luego, la magnetización evoluciona y luego se transfiere de regreso al núcleo I para su observación. Opcionalmente, se puede utilizar un paso de eco de espín adicional para desacoplar la señal, simplificando el espectro al colapsar los multipletes en un solo pico. Las señales desacopladas no deseadas se eliminan ejecutando el experimento dos veces con la fase de un pulso específico invertida; esto invierte los signos de los picos deseados pero no de los no deseados, por lo que restar los dos espectros dará solo los picos deseados. [15]
La espectroscopía de correlación cuántica múltiple heteronuclear (HMQC) proporciona un espectro idéntico al HSQC, pero utiliza un método diferente. Los dos métodos dan resultados de calidad similar para moléculas de tamaño pequeño a mediano, pero se considera que HSQC es superior para moléculas más grandes. [15]
HMBC detecta correlaciones heteronucleares en rangos más largos de aproximadamente 2 a 4 enlaces. La dificultad de detectar correlaciones de enlaces múltiples es que las secuencias HSQC y HMQC contienen un tiempo de retardo específico entre pulsos que permite la detección sólo de un rango alrededor de una constante de acoplamiento específica. Esto no es un problema para los métodos de enlace simple ya que las constantes de acoplamiento tienden a estar en un rango estrecho, pero las constantes de acoplamiento de enlaces múltiples cubren un rango mucho más amplio y no todas pueden capturarse en un solo experimento HSQC o HMQC. [dieciséis]
En HMBC, esta dificultad se supera omitiendo uno de estos retrasos de una secuencia HMQC. Esto aumenta el rango de constantes de acoplamiento que se pueden detectar y también reduce la pérdida de señal por relajación. El costo es que esto elimina la posibilidad de desacoplar el espectro e introduce distorsiones de fase en la señal. Existe una modificación del método HMBC que suprime las señales de un enlace, dejando solo las señales de enlaces múltiples. [dieciséis]
Estos métodos establecen correlaciones entre núcleos físicamente cercanos entre sí independientemente de si existe o no un vínculo entre ellos. Utilizan el efecto nuclear Overhauser (NOE) mediante el cual los átomos cercanos (dentro de aproximadamente 5 Å) experimentan una relajación cruzada mediante un mecanismo relacionado con la relajación de la red de espín .
En NOESY, la relajación cruzada nuclear de Overhauser entre espines nucleares durante el período de mezcla se utiliza para establecer las correlaciones. El espectro obtenido es similar a COSY, con picos diagonales y picos cruzados; sin embargo, los picos cruzados conectan resonancias de núcleos que están espacialmente cerca en lugar de aquellos que están acoplados entre sí mediante enlaces directos. Los espectros NOESY también contienen picos axiales adicionales que no proporcionan información adicional y pueden eliminarse mediante un experimento diferente invirtiendo la fase del primer pulso. [17]
Una aplicación de NOESY es el estudio de biomoléculas grandes, como en la RMN de proteínas , en las que las relaciones a menudo se pueden asignar mediante caminata secuencial .
El experimento NOESY también se puede realizar de forma unidimensional preseleccionando resonancias individuales. Los espectros se leen con los núcleos preseleccionados dando una señal negativa grande, mientras que los núcleos vecinos se identifican mediante señales positivas más débiles. Esto solo revela qué picos tienen NOE mensurables en relación con la resonancia de interés, pero lleva mucho menos tiempo que el experimento 2D completo. Además, si un núcleo preseleccionado cambia de entorno dentro de la escala de tiempo del experimento, se pueden observar múltiples señales negativas. Esto ofrece información de intercambio similar al método de RMN EXSY (espectroscopia de intercambio).
Los experimentos NOESY son una herramienta importante para identificar la estereoquímica de una molécula en disolvente, mientras que la XRD monocristalina se utiliza para identificar la estereoquímica de una molécula en forma sólida.
En HOESY, al igual que NOESY, se utiliza para la relajación cruzada entre espines nucleares. Sin embargo, HOESY puede ofrecer información sobre otros núcleos activos en RMN de manera espacialmente relevante. Los ejemplos incluyen cualquier núcleo X{Y} o X→Y, como 1 H→ 13 C, 19 F→ 13 C, 31 P→ 13 C o 77 Se→ 13 C. Los experimentos suelen observar NOE de protones en X, X { 1 H}, pero no es necesario incluir protones. [18]
ROESY es similar a NOESY, excepto que el estado inicial es diferente. En lugar de observar una relajación cruzada desde un estado inicial de magnetización z , la magnetización de equilibrio se gira sobre el eje x y luego se bloquea por giro mediante un campo magnético externo para que no pueda preceder. Este método es útil para ciertas moléculas cuyo tiempo de correlación rotacional cae en un rango donde el efecto Overhauser nuclear es demasiado débil para ser detectable, generalmente moléculas con un peso molecular alrededor de 1000 daltons , porque ROESY tiene una dependencia diferente entre el tiempo de correlación y la cruz. -tasa de relajación constante. En NOESY, la constante de tasa de relajación cruzada va de positiva a negativa a medida que aumenta el tiempo de correlación, dando un rango cercano a cero, mientras que en ROESY la constante de tasa de relajación cruzada es siempre positiva. [19] [20]
A ROESY a veces se le llama "relajación cruzada apropiada para minimoléculas emuladas por espines bloqueados" (CAMELSPIN). [20]
A diferencia de los espectros correlacionados, los espectros resueltos distribuyen los picos en un experimento de RMN 1D en dos dimensiones sin agregar ningún pico adicional. Estos métodos generalmente se denominan espectroscopia de resolución J, pero a veces también se conocen como espectroscopia de resolución por desplazamiento químico o espectroscopia de resolución δ. Son útiles para analizar moléculas para las cuales los espectros de RMN 1D contienen multipletes superpuestos, ya que el espectro de resolución J desplaza verticalmente el multiplete de cada núcleo en una cantidad diferente. Cada pico en el espectro 2D tendrá la misma coordenada horizontal que tiene en un espectro 1D no desacoplado, pero su coordenada vertical será el desplazamiento químico del pico único que tiene el núcleo en un espectro 1D desacoplado. [21]
Para la versión heteronuclear, la secuencia de pulsos más simple utilizada se llama experimento de Müller-Kumar-Ernst (MKE), que tiene un único pulso de 90° para el heteronúcleo durante el período de preparación, sin período de mezcla, y aplica una señal de desacoplamiento al protón. durante el periodo de detección. Hay varias variantes de esta secuencia de pulsos que son más sensibles y precisas, que se incluyen en las categorías de métodos de desacoplamiento cerrado y métodos de giro-inversión . La espectroscopia homonuclear de resolución J utiliza la secuencia de pulsos de eco de espín . [21]
También se pueden realizar experimentos 3D y 4D, a veces ejecutando secuencias de pulsos de dos o tres experimentos 2D en serie. Sin embargo, muchos de los experimentos 3D comúnmente utilizados son experimentos de triple resonancia ; los ejemplos incluyen los experimentos HNCA y HNCOCA , que a menudo se utilizan en RMN de proteínas .