La epistasis se refiere a interacciones genéticas en las que la mutación de un gen enmascara los efectos fenotípicos de una mutación en otro locus . [1] El análisis sistemático de estas interacciones epistáticas puede proporcionar información sobre la estructura y función de las vías genéticas. Examinar los fenotipos resultantes de pares de mutaciones ayuda a comprender cómo se intersecta la función de estos genes. Las interacciones genéticas generalmente se clasifican como Positivas/Aliviadoras o Negativas/Agravantes. La epistasis de aptitud (una interacción entre genes no alélicos ) es positiva (en otras palabras, decreciente, antagónica o amortiguadora) cuando una mutación de pérdida de función de dos genes dados da como resultado exceder la aptitud predicha a partir de los efectos individuales de las mutaciones deletéreas, y es negativa (es decir, reforzante, sinérgica o agravante) cuando disminuye la aptitud. [2] Ryszard Korona y Lukas Jasnos demostraron que el efecto epistático suele ser positivo en Saccharomyces cerevisiae . Por lo general, incluso en el caso de interacciones positivas, el doble mutante tiene una aptitud menor que los mutantes simples. [2] Las interacciones positivas ocurren a menudo cuando ambos genes se encuentran dentro de la misma vía [3] Por el contrario, las interacciones negativas se caracterizan por un defecto aún más fuerte de lo que se esperaría en el caso de dos mutaciones simples, y en los casos más extremos (enfermo sintético/letal) la doble mutación es letal. Este fenotipo agravado surge cuando ambos genes en vías compensatorias están eliminados .
Los métodos de alto rendimiento para analizar este tipo de interacciones han sido útiles para ampliar nuestro conocimiento sobre las interacciones genéticas. Los arreglos genéticos sintéticos (SGA), el análisis de letalidad sintética basado en diploides en microarreglos (dSLAM) y los perfiles de miniarreglos epistáticos (E-MAP) son tres métodos importantes que se han desarrollado para el análisis y mapeo sistemático de las interacciones genéticas. Este enfoque sistemático para estudiar la epistasis a escala del genoma tiene implicaciones significativas para la genómica funcional . Al identificar las interacciones negativas y positivas entre un gen desconocido y un conjunto de genes dentro de una vía conocida, estos métodos pueden dilucidar la función de genes previamente no caracterizados dentro del contexto de una vía metabólica o de desarrollo.
Para entender cómo la información sobre las interacciones epistáticas se relaciona con las vías genéticas, considere un ejemplo simple de diferenciación de células vulvares en C. elegans . Las células se diferencian de células Pn a células Pn.p a células VP a células vulvares. La mutación de lin-26 [4] bloquea la diferenciación de células Pn a células Pn.p. Los mutantes de lin-36 [5] se comportan de manera similar, bloqueando la diferenciación en la transición a células VP. En ambos casos, el fenotipo resultante está marcado por una ausencia de células vulvares ya que hay un bloqueo aguas arriba en la vía de diferenciación. Un mutante doble en el que ambos genes han sido alterados exhibe un fenotipo equivalente que no es peor que cualquiera de los mutantes simples. La alteración aguas arriba en lin-26 enmascara el efecto fenotípico de una mutación en lin-36 [1] en un ejemplo clásico de una interacción epistática de alivio.
Por otra parte, las mutaciones agravantes dan lugar a un fenotipo que es peor que el efecto acumulativo de cada mutación individual. Este fenotipo agravado es indicativo de dos genes en vías compensatorias. En el caso del mutante simple, una vía paralela es capaz de compensar la pérdida de la vía interrumpida, sin embargo, en el caso del mutante doble, la acción de esta vía compensatoria también se pierde, lo que da lugar al fenotipo más dramático observado. Esta relación ha sido significativamente más fácil de detectar que los fenotipos de alivio más sutiles y se ha estudiado ampliamente en S. cerevisiae a través de pruebas de enfermedad/letalidad sintéticas (SSL) que identifican mutantes dobles con tasas de crecimiento significativamente reducidas.
Cabe señalar que estas conclusiones del análisis de doble mutación, si bien se aplican a muchas vías y mutantes, no son universales. Por ejemplo, los genes pueden actuar en direcciones opuestas en las vías, de modo que la eliminación de ambos produce un fenotipo casi normal, mientras que cada mutante individual se ve gravemente afectado (en direcciones opuestas). Un ejemplo bien estudiado se produce durante el desarrollo temprano en Drosophila, donde los productos genéticos de los genes hunchback y nanos están presentes en el huevo y actúan en direcciones opuestas para dirigir la formación del patrón anteroposterior. Algo similar ocurre a menudo en las vías de transducción de señales, donde la eliminación de un regulador negativo de la vía causa un fenotipo de hiperactivación, mientras que la eliminación de un componente que actúa positivamente produce un fenotipo opuesto. En las vías lineales con una única "salida", cuando las mutaciones eliminadas en dos genes que actúan de manera opuesta se combinan en el mismo individuo, el fenotipo del doble mutante suele ser el mismo que el fenotipo del mutante individual cuyo producto génico normal actúa en sentido descendente en la vía.
Los arreglos genéticos sintéticos (SGA, por sus siglas en inglés) y el análisis de letalidad sintética de microarreglos basado en diploides (dSLAM, por sus siglas en inglés) son dos métodos clave que se han utilizado para identificar mutantes sintéticos enfermos letales y caracterizar relaciones epistáticas negativas. La secuenciación de todo el genoma de la levadura ha hecho posible generar una biblioteca de mutantes knock-out para casi todos los genes del genoma. Estos mutantes con códigos de barras moleculares facilitan enormemente los estudios de epistasis de alto rendimiento, ya que se pueden agrupar y utilizar para generar los mutantes dobles necesarios. Tanto los enfoques SGA como dSLAM se basan en estas cepas knock-out de levadura que se transforman/aparean para generar mutantes dobles haploides. Luego se utiliza el perfil de microarreglos para comparar la aptitud de estos mutantes simples y dobles. En el caso de SGA, los mutantes dobles examinados son haploides y se recolectan después del apareamiento con una cepa mutante seguida de varias rondas de selección. Las cepas dSLAM de mutantes simples y dobles se originan de la misma cepa heterocigota diploide (indicada por “diploide” de “dSLAM”). En el caso del análisis dSLAM, la aptitud de mutantes simples y dobles se evalúa mediante análisis de microarrays de un ensayo de competencia de crecimiento.
Para desarrollar una comprensión más completa de las interacciones genéticas, los enfoques experimentales están abandonando esta clasificación binaria de los fenotipos como de tipo salvaje o sintéticos letales. El enfoque E-MAP es particularmente convincente debido a su capacidad para destacar tanto los efectos paliativos como los agravantes, y esta capacidad es lo que distingue a este método de otros como SGA y dSLAM. Además, el E-MAP no solo identifica ambos tipos de interacciones, sino que también reconoce gradaciones en estas interacciones y la gravedad del fenotipo enmascarado, representado por la puntuación de interacción aplicada a cada par de genes.
Los E-MAP aprovechan un enfoque SGA para analizar las interacciones genéticas de una manera de alto rendimiento . Si bien el método se desarrolló particularmente para examinar la epistasis en S. cerevisiae, también podría aplicarse a otros organismos modelo . Un E-MAP recopila datos generados a partir de la generación sistemática de cepas mutantes dobles para un gran grupo claramente definido de genes. Cada respuesta fenotípica se cuantifica mediante imágenes del tamaño de la colonia para determinar la tasa de crecimiento. Esta puntuación de aptitud se compara con la aptitud prevista para cada mutante individual, lo que da como resultado una puntuación de interacción genética. La agrupación jerárquica de estos datos para agrupar genes con perfiles de interacción similares permite la identificación de relaciones epistáticas entre genes con y sin función conocida. Al ordenar los datos de esta manera, los genes que se sabe que interactúan se agruparán junto con los genes que exhiben un patrón similar de interacciones pero cuya función aún no se ha identificado. Por lo tanto, los datos E-MAP pueden colocar genes en nuevas funciones dentro de vías bien caracterizadas. Consideremos, por ejemplo, el E-MAP presentado por Collins et al. que agrupa el factor de elongación transcripcional Dst1 [6] junto con componentes de la región media del complejo Mediator, que está involucrado en la regulación transcripcional . [7] Esto sugiere un nuevo rol para Dst1, funcionando en conjunto con Mediator.
La elección de los genes examinados dentro de un E-MAP dado es fundamental para lograr resultados fructíferos. Es particularmente importante que un subconjunto significativo de los genes examinados estén bien establecidos en la literatura. Estos genes pueden, por lo tanto, actuar como controles para el E-MAP, lo que permite una mayor certeza en el análisis de los datos de genes no caracterizados. Los grupos organizados por localización subcelular y procesos celulares generales (por ejemplo, ciclo celular ) han producido resultados rentables en S. cerevisiae. Los datos de los estudios de interacción proteína-proteína también pueden proporcionar una base útil para seleccionar grupos de genes para los datos E-MAP. Esperaríamos que los genes que exhiben interacciones físicas también demuestren interacciones a nivel genético y, por lo tanto, estos pueden servir como controles adecuados para los datos E-MAP. Collins et al. (2007) llevaron a cabo una comparación de las puntuaciones E-MAP y los datos de interacción física de los métodos de purificación por afinidad a gran escala (AP-MS) y sus datos demuestran que un enfoque E-MAP identifica interacciones proteína-proteína con una especificidad igual a la de los métodos tradicionales como AP-MS.
Sin embargo, los métodos de alto rendimiento para examinar las relaciones epistáticas enfrentan dificultades, ya que el número de pares de genes posibles es extremadamente grande (~20 millones en S. cerevisiae) y la densidad estimada de interacciones genéticas es bastante baja. [8] Estas dificultades se pueden contrarrestar examinando todas las interacciones posibles en un solo grupo de genes en lugar de examinar pares en todo el genoma. Si se eligen bien, estos grupos funcionales contienen una densidad significativamente mayor de interacciones genéticas que otras regiones del genoma y, por lo tanto, permiten una mayor tasa de detección al tiempo que reducen drásticamente el número de pares de genes a examinar. [8]
La generación de datos para el E-MAP depende de la creación de miles de cepas mutantes dobles; un estudio de 483 alelos, por ejemplo, dio como resultado un E-MAP con ~100.000 pares de mutantes dobles distintos. Sin embargo, la generación de bibliotecas de mutantes de genes esenciales presenta dificultades significativas, ya que estas mutaciones tienen un fenotipo letal. Por lo tanto, los estudios de E-MAP dependen de cepas con niveles de expresión intermedios de estos genes. La disminución de la abundancia mediante la estrategia de perturbación del ARN mensajero (DAmP) es particularmente común para la generación de alto rendimiento de mutantes necesarios para este tipo de análisis y permite la interrupción parcial de genes esenciales sin pérdida de viabilidad. [9] DAmP se basa en la desestabilización de las transcripciones de ARNm mediante la integración de un marcador seleccionable por antibiótico en el 3'UTR, aguas abajo del codón de terminación (figura 2). Los ARNm con transcripciones extendidas en 3' son rápidamente seleccionados para la degradación y el resultado es una regulación negativa del gen de interés mientras permanece bajo el control de su promotor nativo. En el caso de genes no esenciales, se pueden utilizar cepas delecionadas. El marcado de los sitios delecionados con códigos de barras moleculares, secuencias únicas de 20 pb, permite la identificación y el estudio de los niveles de aptitud relativa en cada cepa mutante.