En bioquímica o química , el ensayo de unión de filtro es una forma sencilla de estudiar rápidamente muchas muestras. Una de las formas de aprender sobre una interacción entre dos moléculas es determinar la constante de unión , que es un número que describe la proporción de moléculas unidas y no unidas. Esta información revela la afinidad entre las dos moléculas y permite predecir la cantidad unida dado cualquier conjunto de condiciones iniciales.
Para medir una constante de unión, se debe encontrar una manera de medir la cantidad de complejo formado en un rango de concentraciones iniciales. Esto se puede lograr "etiquetando" una de las especies con una etiqueta fluorescente o, en este caso, radiactiva . El ADN se "marca" mediante la adición de fosfato radiactivo derivado del trifosfato de adenosina .
Un ensayo de unión de filtro mide las afinidades entre dos moléculas (a menudo proteínas y ADN) utilizando un filtro . El filtro está construido con papel de nitrocelulosa , que tiene carga negativa. Dado que la mayoría de las proteínas tienen una carga neta positiva, el papel de nitrocelulosa es ideal para inmovilizar proteínas. El ADN está cargado negativamente debido a la columna vertebral de fosfato y no se "pega" a la nitrocelulosa por sí solo; sin embargo, cualquier ADN que haya estado unido a una proteína se pegará. La cantidad exacta de ADN "pegado" a la nitrocelulosa se cuantifica midiendo la cantidad de radiactividad en el filtro utilizando un contador de centelleo .
La proteína y el ADN se mezclan en una serie de tubos de microcentrífuga en los que la cantidad de ADN se mantiene constante, pero la cantidad de proteína aumenta gradualmente. Se deja que estas muestras se equilibren. Después del equilibrio, se rocía un volumen igual de cada tubo sobre filtros de nitrocelulosa pequeños y redondos que están dispuestos sobre una placa de vacío (una superficie plana a la que se aplica un vacío desde abajo para aspirar el líquido hacia abajo). Toda la proteína se adherirá, pero sólo la proteína que se ha unido al ADN se registrará en el contador de centelleo .
Ahora tendrá un número que describe la cantidad de ADN unido para cada concentración de proteína utilizada; esta información se puede representar gráficamente en una curva de unión para determinar la constante de unión .
Este ensayo ya no se utiliza mucho, pero es rápido y sencillo y puede proporcionar mucha información. Se utilizaría para análisis relativamente detallados de una interacción proteína-ADN particular, por ejemplo.
Mida la constante de equilibrio:
Mida la tasa de descuento:
Otra forma de medir la tasa de descuento: