Los lectores de placas , también conocidos como lectores de microplacas o fotómetros de microplacas , son instrumentos que se utilizan para detectar eventos biológicos , químicos o físicos de muestras en placas de microtitulación . Se utilizan ampliamente en investigación, descubrimiento de fármacos , [1] validación de bioensayos, control de calidad y procesos de fabricación en la industria farmacéutica y biotecnológica y en organizaciones académicas. Las reacciones de las muestras se pueden analizar en placas de microtitulación con formato de 1-1536 pocillos. El formato de microplaca más común utilizado en laboratorios de investigación académica o laboratorios de diagnóstico clínico es el de 96 pocillos (matriz de 8 por 12) con un volumen de reacción típico de entre 100 y 200 μl por pocillo. Las microplacas de mayor densidad (microplacas de 384 o 1536 pocillos) se utilizan normalmente para aplicaciones de detección, cuando el rendimiento (número de muestras procesadas por día) y el costo del ensayo por muestra se convierten en parámetros críticos, con un volumen de ensayo típico entre 5 y 50 μL por pocillo. . Los modos de detección comunes para los ensayos de microplacas son absorbancia, intensidad de fluorescencia , luminiscencia , fluorescencia resuelta en el tiempo y polarización de fluorescencia .
La detección de absorbancia ha estado disponible en lectores de microplacas durante más de tres décadas y se utiliza para ensayos como ensayos ELISA , cuantificación de proteínas y ácidos nucleicos o ensayos de actividad enzimática [2] (es decir, en el ensayo MTT para la viabilidad celular). [3] Una fuente de luz ilumina la muestra usando una longitud de onda específica (seleccionada mediante un filtro óptico o un monocromador), y un detector de luz ubicado en el otro lado del pozo mide cuánta luz inicial (100%) se transmite. a través de la muestra: la cantidad de luz transmitida normalmente estará relacionada con la concentración de la molécula de interés. Se han miniaturizado varios análisis colorimétricos convencionales para que funcionen cuantitativamente en un lector de placas, con un rendimiento adecuado para fines de investigación. Ejemplos de análisis convertidos a métodos de lectura de placas incluyen varios para amonio , nitrato , nitrito , [4] urea , [5] hierro (II), [6] y ortofosfato . [7] Se han desarrollado químicas colorimétricas más recientes directamente para su uso en lectores de placas. [8]
La detección de la intensidad de la fluorescencia se ha desarrollado ampliamente en el formato de microplacas durante las últimas dos décadas. La gama de aplicaciones es mucho más amplia que cuando se utiliza la detección de absorbancia, pero la instrumentación suele ser más cara. En este tipo de instrumentación, un primer sistema óptico (sistema de excitación) ilumina la muestra utilizando una longitud de onda específica (seleccionada mediante un filtro óptico o un monocromador). Como resultado de la iluminación, la muestra emite luz (fluorescente) y un segundo sistema óptico (sistema de emisión) recoge la luz emitida, la separa de la luz de excitación (mediante un filtro o sistema monocromador) y mide la señal mediante un detector de luz como un tubo fotomultiplicador (PMT). Las ventajas de la detección por fluorescencia sobre la detección por absorbancia son la sensibilidad y el rango de aplicación, dada la amplia selección de etiquetas fluorescentes disponibles en la actualidad. Por ejemplo, una técnica conocida como imágenes de calcio mide la intensidad de fluorescencia de tintes sensibles al calcio para evaluar los niveles de calcio intracelular. [9]
La luminiscencia es el resultado de una reacción química o bioquímica. La detección de luminiscencia es ópticamente más simple que la detección de fluorescencia porque la luminiscencia no requiere una fuente de luz para la excitación ni una óptica para seleccionar longitudes de onda de excitación discretas. Un sistema óptico de luminiscencia típico consta de una cámara de lectura hermética a la luz y un detector PMT . Algunos lectores de placas utilizan un detector PMT analógico, mientras que otros tienen un detector PMT con recuento de fotones . El conteo de fotones es ampliamente aceptado como el medio más sensible para detectar luminiscencia. Algunos lectores de placas ofrecen rueda de filtros o sistemas ópticos monocromadores de longitud de onda sintonizable para seleccionar longitudes de onda luminiscentes específicas. La capacidad de seleccionar múltiples longitudes de onda, o incluso rangos de longitud de onda, permite la detección de ensayos que contienen múltiples enzimas informadoras luminiscentes, el desarrollo de nuevos ensayos de luminiscencia, así como un medio para optimizar la relación señal-ruido. [ cita necesaria ]
Las aplicaciones comunes incluyen ensayos de expresión genética basados en luciferasa , así como ensayos de viabilidad celular, citotoxicidad y biorritmo basados en la detección luminiscente de ATP . [10]
La medición de la fluorescencia resuelta en el tiempo (TRF) es muy similar a la medición de la intensidad de la fluorescencia (FI). La única diferencia es el momento del proceso de excitación/medición. Al medir FI, los procesos de excitación y emisión son simultáneos: la luz emitida por la muestra se mide mientras se produce la excitación. Aunque los sistemas de emisión son muy eficientes para eliminar la luz de excitación antes de que llegue al detector, la cantidad de luz de excitación en comparación con la luz de emisión es tal que las mediciones de FI siempre muestran señales de fondo bastante elevadas. TRF ofrece una solución a este problema. Se basa en el uso de moléculas fluorescentes muy específicas, llamadas lantánidos , que tienen la inusual propiedad de emitir durante largos períodos de tiempo (medidos en milisegundos) después de la excitación, cuando la mayoría de los tintes fluorescentes estándar (por ejemplo, la fluoresceína) emiten a los pocos nanosegundos de ser entusiasmado. De este modo es posible excitar los lantánidos mediante una fuente de luz pulsada (por ejemplo, una lámpara de destellos de xenón o un láser pulsado) y medir después del impulso de excitación. Esto da como resultado fondos de medición más bajos que en los ensayos FI estándar. Los inconvenientes son que la instrumentación y los reactivos suelen ser más caros y que las aplicaciones tienen que ser compatibles con el uso de estos colorantes de lantánidos muy específicos. El uso principal de TRF se encuentra en aplicaciones de detección de drogas, bajo una forma llamada TR-FRET (transferencia de energía de fluorescencia resuelta en el tiempo). Los ensayos TR- FRET son muy robustos (sensibilidad limitada a varios tipos de interferencias del ensayo) y se miniaturizan fácilmente. La robustez, la capacidad de automatizar y miniaturizar son características muy atractivas en un laboratorio de cribado. [ cita necesaria ]
La medición de la polarización de la fluorescencia también está muy cerca de la detección de FI. La diferencia es que el sistema óptico incluye filtros polarizadores en el camino de la luz: las muestras en la microplaca se excitan usando luz polarizada (en lugar de luz no polarizada en los modos FI y TRF). Dependiendo de la movilidad de las moléculas fluorescentes que se encuentran en los pocillos, la luz emitida estará polarizada o no. Por ejemplo, las moléculas grandes (por ejemplo, proteínas) en solución, que giran relativamente lentamente debido a su tamaño, emitirán luz polarizada cuando se excitan con luz polarizada. Por otro lado, la rápida rotación de moléculas más pequeñas provocará una despolarización de la señal. El sistema de emisión del lector de placas utiliza filtros polarizadores para analizar la polaridad de la luz emitida. Un nivel bajo de polarización indica que pequeñas moléculas fluorescentes se mueven libremente en la muestra. Un alto nivel de polarización indica que el fluorescente está unido a un complejo molecular más grande. Como resultado, una de las aplicaciones básicas de la detección de FP son los ensayos de unión molecular, ya que permiten detectar si una pequeña molécula fluorescente se une (o no) a una molécula más grande y no fluorescente: la unión da como resultado una velocidad de rotación más lenta de la molécula fluorescente, y en un aumento de la polarización de la señal. [ cita necesaria ]
La dispersión de luz y la nefelometría son métodos para determinar la turbiedad de una solución (es decir, partículas insolubles en una solución). Un haz de luz atraviesa la muestra y la luz es dispersada por las partículas suspendidas. La luz dispersada hacia adelante medida indica la cantidad de partículas insolubles presentes en la solución. Las aplicaciones comunes de nefelometría/dispersión de luz incluyen la detección automatizada de solubilidad de fármacos HTS, la cinética de crecimiento microbiano a largo plazo, la floculación, la agregación y el seguimiento de la polimerización y precipitación, incluida la inmunoprecipitación. [ cita necesaria ]
Muchos de los modos de detección (absorbancia, intensidad de fluorescencia, luminiscencia, fluorescencia resuelta en el tiempo y polarización de fluorescencia) están disponibles de forma independiente en lectores de placas dedicados, pero hoy en día se encuentran muy a menudo combinados en un solo instrumento (lector de placas multimodo). También existen instrumentos para medir la luz dinámica o estática dispersada por muestras en una microplaca. La gama de aplicaciones para lectores de placas multimodo es extremadamente amplia. Algunos de los ensayos más comunes son:
Si bien "lector de placas" generalmente se refiere a los dispositivos descritos anteriormente, hay muchas variaciones disponibles. Algunos ejemplos de otros dispositivos que funcionan con el formato de microplacas son: