Ensambladores de secuencias de novo

Software en bioinformática

Los ensambladores de secuencias de novo son un tipo de programa que ensambla secuencias de nucleótidos cortas en secuencias más largas sin el uso de un genoma de referencia . Estos se utilizan con mayor frecuencia en estudios bioinformáticos para ensamblar genomas o transcriptomas . Dos tipos comunes de ensambladores de novo son los ensambladores de algoritmos voraces y los ensambladores de gráficos de De Bruijn .

Tipos de ensambladores de novo

Existen dos tipos de algoritmos que estos ensambladores utilizan habitualmente: greedy , que apunta a óptimos locales , y algoritmos de método de grafos, que apuntan a óptimos globales . Los distintos ensambladores se adaptan a necesidades particulares, como el ensamblaje de genomas bacterianos (pequeños), genomas eucariotas (grandes) o transcriptomas.

Los ensambladores de algoritmos voraces son ensambladores que encuentran óptimos locales en alineaciones de lecturas más pequeñas . Los ensambladores de algoritmos voraces suelen presentar varios pasos: 1) cálculo de la distancia por pares de lecturas, 2) agrupamiento de lecturas con mayor superposición, 3) ensamblaje de lecturas superpuestas en contigs más grandes y 4) repetición. Estos algoritmos normalmente no funcionan bien para conjuntos de lecturas más grandes, ya que no alcanzan fácilmente un óptimo global en el ensamblaje y no funcionan bien en conjuntos de lecturas que contienen regiones de repetición. ^[1] Los primeros ensambladores de secuencias de novo, como SEQAID ^[2] (1984) y CAP ^[3] (1992), usaban algoritmos voraces, como los algoritmos de superposición-diseño-consenso (OLC). Estos algoritmos encuentran superposición entre todas las lecturas, usan la superposición para determinar un diseño (o mosaico) de las lecturas y luego producen una secuencia de consenso. Algunos programas que utilizaban algoritmos OLC incluían filtración (para eliminar pares de lectura que no se superponían) y métodos heurísticos para aumentar la velocidad de los análisis.

Los ensambladores de métodos de grafos ^[4] vienen en dos variedades: de cadenas y De Bruijn. Los ensambladores de métodos de grafos de cadenas y de grafos De Bruijn fueron presentados en un taller de DIMACS ^{[5] en 1994 por} Waterman ^[6] y Gene Myers ^[7] . Estos métodos representaron un importante paso adelante en el ensamblaje de secuencias, ya que ambos usan algoritmos para alcanzar un óptimo global en lugar de un óptimo local. Si bien ambos métodos avanzaron hacia mejores ensamblajes, el método de grafos De Bruijn se ha convertido en el más popular en la era de la secuenciación de próxima generación. Durante el ensamblaje del grafo De Bruijn, las lecturas se dividen en fragmentos más pequeños de un tamaño específico, k. Luego, los k-meros se usan como bordes en el ensamblaje del grafo. Los nodos se construyen como (k-1)-meros conectados por un borde. Luego, el ensamblador construirá secuencias basadas en el grafo De Bruijn. Los ensambladores de grafos De Bruijn generalmente funcionan mejor en conjuntos de lecturas más grandes que los ensambladores de algoritmos voraces (especialmente cuando contienen regiones repetidas).

Programas de uso común

Se diseñan distintos ensambladores para distintos tipos de tecnologías de lectura. Las lecturas de tecnologías de segunda generación (llamadas tecnologías de lectura corta) como Illumina son típicamente cortas (con longitudes del orden de 50-200 pares de bases) y tienen tasas de error de alrededor del 0,5-2%, siendo los errores principalmente errores de sustitución. Sin embargo, las lecturas de tecnologías de tercera generación como PacBio y tecnologías de cuarta generación como Oxford Nanopore (llamadas tecnologías de lectura larga) son más largas, con longitudes de lectura típicamente de miles o decenas de miles y tienen tasas de error mucho más altas de alrededor del 10-20%, siendo los errores principalmente inserciones y eliminaciones. Esto requiere diferentes algoritmos para el ensamblaje de tecnologías de lectura corta y larga.

Maratón de asambleas

Existen numerosos programas para el ensamblaje de secuencias de novo y muchos de ellos se han comparado en el Assemblathon. El Assemblathon es un esfuerzo periódico y colaborativo para probar y mejorar los numerosos ensambladores disponibles. Hasta ahora, se han completado dos assemblatones (2011 y 2013) y un tercero está en curso (a fecha de abril de 2017). Equipos de investigadores de todo el mundo eligen un programa y ensamblan genomas simulados (Assemblathon 1) y los genomas de organismos modelo que se han ensamblado y anotado previamente (Assemblathon 2). A continuación, los ensamblajes se comparan y evalúan utilizando numerosas métricas.

Maratón de asamblea 1

En 2011 se llevó a cabo el primer Ensamblathon ^[23] , en el que participaron 59 ensamblajes de 17 grupos diferentes y los organizadores. El objetivo de este Ensamblathon era ensamblar de la forma más precisa y completa un genoma que constaba de dos haplotipos (cada uno con tres cromosomas de 76,3, 18,5 y 17,7 Mb, respectivamente) que se generó utilizando Evolver. Se utilizaron numerosas métricas para evaluar los ensamblajes, entre ellas: NG50 (punto en el que se alcanza el 50 % del tamaño total del genoma cuando se suman las longitudes de los andamios desde el más largo al más corto), LG50 (número de andamios que son mayores o iguales a la longitud N50), cobertura del genoma y tasa de error de sustitución.

• Comparación de software: ABySS, Phusion2, phrap, Velvet, SOAPdenovo, PRICE, ALLPATHS-LG
• Análisis N50: los ensamblajes del Plant Genome Assembly Group (utilizando el ensamblador Meraculous) y ALLPATHS, Broad Institute, EE. UU. (utilizando ALLPATHS-LG) obtuvieron el mejor rendimiento en esta categoría, por un orden de magnitud por encima de otros grupos. Estos ensamblajes obtuvieron un N50 de >8 000 000 de bases.
• Cobertura del genoma por ensamblaje: para esta métrica, el ensamblaje de BGI a través de SOAPdenovo tuvo el mejor desempeño, con un 98,8 % del genoma total cubierto. Todos los ensambladores tuvieron un desempeño relativamente bueno en esta categoría, con todos los grupos excepto tres con una cobertura del 90 % o más, y la cobertura total más baja fue del 78,5 % (Dept. of Comp. Sci., University of Chicago, EE. UU. a través de Kiki).
• Errores de sustitución: el conjunto con la tasa de error de sustitución más baja fue enviado por el equipo del Wellcome Trust Sanger Institute, Reino Unido, utilizando el software SGA.
• En general: ningún ensamblador obtuvo un rendimiento significativamente mejor que los demás en todas las categorías. Si bien algunos ensambladores sobresalieron en una categoría, no lo hicieron en otras, lo que sugiere que aún hay mucho margen de mejora en la calidad del software ensamblador.

Maratón de asamblea 2

El Assemblathon 2 ^[24] mejoró el Assemblathon 1 al incorporar los genomas de múltiples vertebrados (un ave ( Melopsittacus undulatus ), un pez ( Maylandia zebra ) y una serpiente ( Boa constrictor constrictor )) con genomas estimados en 1,2, 1,0 y 1,6 Gbp de longitud) y la evaluación mediante más de 100 métricas. Cada equipo tuvo cuatro meses para ensamblar su genoma a partir de datos de secuencia de próxima generación (NGS), incluidos datos de secuencia de Illumina y Roche 454 .

• Comparación de software: ABySS, ALLPATHS-LG, PRICE, Ray y SOAPdenovo
• Análisis N50: para el ensamblaje del genoma de las aves, los equipos del Centro de Secuenciación del Genoma Humano del Baylor College of Medicine y ALLPATHS tuvieron los NG50 más altos, con más de 16.000.000 y más de 14.000.000 pb, respectivamente.
• Presencia de genes centrales: la mayoría de los ensamblajes tuvieron un buen desempeño en esta categoría (~80% o más), y solo uno cayó a poco más del 50% en su ensamblaje del genoma de las aves (Universidad Estatal de Wayne a través de HyDA).
• En general: en general, el Centro de secuenciación del genoma humano del Baylor College of Medicine, que utiliza una variedad de métodos de ensamblaje (SeqPrep, KmerFreq, Quake, BWA, Newbler, ALLPATHS-LG, Atlas-Link, Atlas-GapFill, Phrap, CrossMatch, Velvet, BLAST y BLASR), obtuvo el mejor rendimiento en los ensamblajes de aves y peces. En el ensamblaje del genoma de la serpiente, el Wellcome Trust Sanger Institute, que utilizó SGA, obtuvo el mejor rendimiento. En todos los ensamblajes, SGA, BCM, Meraculous y Ray presentaron ensamblajes y evaluaciones competitivos. Los resultados de los muchos ensamblajes y evaluaciones descritos aquí sugieren que, si bien un ensamblador puede tener un buen rendimiento en una especie, puede no tener un rendimiento tan bueno en otra. Los autores hacen varias sugerencias para el ensamblaje: 1) utilizar más de un ensamblador, 2) utilizar más de una métrica para la evaluación, 3) seleccionar un ensamblador que se destaque en métricas de mayor interés (por ejemplo, N50, cobertura), 4) N50 bajos o tamaños de ensamblaje bajos pueden no ser preocupantes, dependiendo de las necesidades del usuario, y 5) evaluar los niveles de heterocigosidad en el genoma de interés.

Véase también

• Ensamblaje de secuencias
• Alineación de secuencias
• Montaje del transcriptoma de novo

Referencias

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