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Cuerpo embrioide

texto
Imagen de fase de los EB en cultivo en suspensión. Los EB individuales están compuestos por aproximadamente 1000 mESC
Un cuerpo embrionario cuyas células se diferenciaron en cardiomiocitos que laten espontáneamente y expresan proteínas de fluorescencia verde mejorada .

Los cuerpos embrionarios ( CE ) son agregados tridimensionales formados por células madre pluripotentes . Entre ellas se encuentran las células madre embrionarias (CME) y las células madre pluripotentes inducidas (CPI).

Los EB son células madre embrionarias humanas que se diferencian en cuerpos embrionarios que comprenden las tres capas germinales embrionarias. Imitan las características observadas en los embriones en etapa temprana. A menudo se utilizan como un sistema modelo para realizar investigaciones sobre diversos aspectos de la biología del desarrollo. También pueden contribuir a la investigación centrada en la ingeniería de tejidos y la medicina regenerativa.

Fondo

Los tipos de células pluripotentes que componen los cuerpos embrionarios incluyen células madre embrionarias (CME) derivadas de la etapa de blastocisto de embriones de fuentes de ratón (mCME), [1] [2] primate, [3] y humano (hCME) [4] . Además, las CE se pueden formar a partir de células madre embrionarias derivadas a través de técnicas alternativas, incluida la transferencia nuclear de células somáticas [5] [6] [7] o la reprogramación de células somáticas para producir células madre pluripotentes inducidas (iPS). [8] [9] [10] [11] De manera similar a las CME cultivadas en formatos de monocapa , las CME dentro de los cuerpos embrionarios experimentan diferenciación y especificación celular a lo largo de los tres linajes germinales : endodermo, ectodermo y mesodermo, que comprenden todos los tipos de células somáticas . [12] [13]

Sin embargo, a diferencia de los cultivos en monocapa, las estructuras esferoides que se forman cuando las ESC se agregan permiten el cultivo no adherente de EB en suspensión, lo que hace que los cultivos de EB sean inherentemente escalables, lo que es útil para los enfoques de bioprocesamiento, mediante los cuales se pueden producir grandes rendimientos de células para posibles aplicaciones clínicas. [14] Además, aunque los EB exhiben en gran medida patrones heterogéneos de tipos de células diferenciadas, las ESC son capaces de responder a señales similares que dirigen el desarrollo embrionario . [15] Por lo tanto, la estructura tridimensional, incluido el establecimiento de adhesiones celulares complejas y señalización paracrina dentro del microambiente de EB, [16] permite la diferenciación y morfogénesis que produce microtejidos que son similares a las estructuras de tejido nativo. Dichos microtejidos son prometedores para reparar directamente [15] o indirectamente [17] [18] tejido dañado o enfermo en aplicaciones de medicina regenerativa, así como para pruebas in vitro en la industria farmacéutica y como modelo de desarrollo embrionario.

Formación

Los EB se forman por la unión homofílica de la molécula de adhesión dependiente de Ca2+ E-cadherina , que se expresa altamente en las ESC indiferenciadas. [19] [20] [21] Cuando se cultivan como células individuales en ausencia de factores antidiferenciación, las ESC se agregan espontáneamente para formar EB. [19] [22] [23] [24] Dicha formación espontánea a menudo se logra en cultivos de suspensión a granel mediante los cuales la placa se recubre con materiales no adhesivos, como agar o polímeros hidrófilos, para promover la adhesión preferencial entre células individuales, en lugar de al sustrato de cultivo. Como las hESC experimentan apoptosis cuando se cultivan como células individuales, la formación de EB a menudo requiere el uso de inhibidores de la vía de la quinasa asociada a rho (ROCK), incluidas las moléculas pequeñas Y-27632 [25] y tiazol 2,4 disustituido (Tiazovivina/Tzv). [26] Como alternativa, para evitar la disociación en células individuales, se pueden formar EB a partir de hESC mediante la separación manual de colonias adherentes (o regiones de colonias) y posteriormente cultivarlas en suspensión. La formación de EB en suspensión permite la formación de grandes cantidades de EB, pero proporciona poco control sobre el tamaño de los agregados resultantes, lo que a menudo conduce a EB grandes y de forma irregular. Como alternativa, las fuerzas hidrodinámicas impartidas en plataformas de cultivo mixtas aumentan la homogeneidad de los tamaños de EB cuando las ESC se inoculan dentro de suspensiones a granel. [27]

La formación de EB también se puede controlar con mayor precisión mediante la inoculación de densidades celulares conocidas dentro de gotas individuales (10-20 μL) suspendidas de la tapa de una placa de Petri, conocidas como gotas colgantes. [21] Si bien este método permite el control del tamaño de EB alterando el número de células por gota, la formación de gotas colgantes requiere mucha mano de obra y no es fácil de adaptar a cultivos escalables. Además, los medios no se pueden intercambiar fácilmente dentro del formato tradicional de gotas colgantes, lo que requiere la transferencia de gotas colgantes a cultivos de suspensión a granel después de 2 a 3 días de formación, por lo que los EB individuales tienden a aglomerarse. Recientemente, se han desarrollado nuevas tecnologías para permitir el intercambio de medios dentro de un formato de gota colgante modificado. [28] Además, también se han desarrollado tecnologías para separar físicamente las células mediante la agregación forzada de ESC dentro de pocillos individuales o confinadas en sustratos adhesivos, [29] [30] [31] [32] lo que permite un mayor rendimiento y la formación controlada de EB. En última instancia, los métodos utilizados para la formación de EB pueden afectar la heterogeneidad de las poblaciones de EB, en términos de cinética de agregación, tamaño y rendimiento de EB, así como trayectorias de diferenciación. [31] [33] [34]

Diferenciación dentro de los EB

En el contexto de los protocolos de diferenciación de ESC , la formación de EB se utiliza a menudo como un método para iniciar la diferenciación espontánea hacia los tres linajes germinales . La diferenciación de EB comienza con la especificación de las células exteriores hacia el fenotipo de endodermo primitivo. [35] [36] Las células en el exterior luego depositan matriz extracelular (ECM), que contiene colágeno IV y laminina , [37] [38] similar a la composición y estructura de la membrana basal . En respuesta a la deposición de ECM, los EB a menudo forman una cavidad quística, por la cual las células en contacto con la membrana basal permanecen viables y las del interior experimentan apoptosis, lo que resulta en una cavidad llena de líquido rodeada de células. [39] [40] [41] La diferenciación posterior procede a formar derivados de los tres linajes germinales. En ausencia de suplementos, la diferenciación "predeterminada" de las ESC es en gran medida hacia el ectodermo y los linajes neuronales posteriores . [42] Sin embargo, se han desarrollado composiciones de medios alternativos, incluido el uso de suero bovino fetal , así como aditivos de factores de crecimiento definidos, para promover la diferenciación hacia linajes de mesodermo y endodermo . [43] [44] [45]

Como resultado de la estructura tridimensional de los EB, se produce una morfogénesis compleja durante la diferenciación de los EB, incluida la aparición de poblaciones de células epiteliales y mesenquimales, así como la aparición de marcadores asociados con la transición epitelial-mesenquimal (EMT). [46] [47] Además, los efectos inductivos resultantes de la señalización entre poblaciones celulares en los EB dan como resultado cambios definidos espacial y temporalmente, que promueven una morfogénesis compleja . [48] Las estructuras similares a tejidos a menudo se exhiben dentro de los EB, incluida la aparición de islas de sangre que recuerdan a las estructuras de los vasos sanguíneos tempranos en el embrión en desarrollo, así como el patrón de extensiones de neuritas (indicativo de la organización de las neuronas) y la actividad contráctil espontánea (indicativo de la diferenciación de los cardiomiocitos ) cuando los EB se colocan sobre sustratos adhesivos como la gelatina . [13] Más recientemente, se crearon in vitro estructuras complejas, incluidas estructuras similares a copas ópticas, resultantes de la diferenciación de los EB. [49]

Paralelismos con el desarrollo embrionario

Gran parte de la investigación central sobre la diferenciación y morfogénesis de células madre embrionarias se deriva de estudios en biología del desarrollo y embriogénesis de mamíferos. [15] Por ejemplo, inmediatamente después de la etapa de desarrollo de blastocisto (de donde se derivan las ESC), el embrión experimenta una diferenciación, por la cual la especificación celular de la masa celular interna da como resultado la formación del hipoblasto y el epiblasto . [50] Más tarde en el desarrollo postimplantación, se forma el eje anteroposterior y el embrión desarrolla una estructura transitoria conocida como la línea primitiva. [51] Gran parte del patrón espacial que ocurre durante la formación y migración de la línea primitiva resulta de la secreción de agonistas y antagonistas por varias poblaciones celulares, incluidos los factores de crecimiento de las familias Wnt y del factor de crecimiento transformante β (TGFβ) (Lefty 1, Nodal), así como represores de las mismas moléculas (Dkk-1, Sfrp1, Sfrp5). [52] [53] [54] Debido a las similitudes entre la embriogénesis y la diferenciación de ESC, muchos de los mismos factores de crecimiento son fundamentales para los enfoques de diferenciación dirigida.

Además, los avances en el cultivo de EB dieron como resultado el desarrollo de organoides embrionarios (gastruloides) que muestran notables paralelismos con el desarrollo embrionario [46] [55] [56] [57] [58] [59] como la ruptura de la simetría, la expresión localizada de braquiuria , la formación de los ejes embrionarios (anteroposterior, dorsoventral e izquierda-derecha) y movimientos similares a la gastrulación. [46] [55] [56] [57]

Desafíos para dirigir la diferenciación

A diferencia de la diferenciación de las ESC en cultivos de monocapa, mediante la cual la adición de morfógenos solubles y el microambiente extracelular se pueden controlar de forma precisa y homogénea, la estructura tridimensional de los EB plantea desafíos para la diferenciación dirigida. [16] [60] Por ejemplo, la población de endodermo visceral que forma el exterior de los EB, crea una "capa" exterior que consiste en células epiteliales estrechamente conectadas , así como una matriz extracelular densa . [61] [62] Debido a tales restricciones físicas, en combinación con el tamaño de los EB, se producen limitaciones de transporte dentro de los EB, lo que crea gradientes de morfógenos, metabolitos y nutrientes. [60] Se ha estimado que el transporte de oxígeno está limitado en agregados celulares de más de aproximadamente 300 μm de diámetro; [63] sin embargo, el desarrollo de tales gradientes también se ve afectado por el tamaño de la molécula y las tasas de absorción celular. Por lo tanto, la administración de morfógenos a los EB da como resultado una mayor heterogeneidad y una menor eficiencia de las poblaciones de células diferenciadas en comparación con los cultivos en monocapa. Un método para abordar las limitaciones del transporte dentro de los EB ha sido mediante la administración polimérica de morfógenos desde dentro de la estructura del EB. [61] [64] [65] Además, los EB se pueden cultivar como microtejidos individuales y posteriormente ensamblarse en estructuras más grandes para aplicaciones de ingeniería de tejidos. [66] Aunque la complejidad resultante de las adhesiones tridimensionales y la señalización puede recapitular más estructuras de tejido nativo, [67] [68] también crea desafíos para comprender las contribuciones relativas de las señales mecánicas, químicas y físicas a los fenotipos celulares resultantes y la morfogénesis.

Véase también

Referencias

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