La electroforesis en gel de campo pulsado ( PFGE ) es una técnica utilizada para la separación de grandes moléculas de ADN aplicando a una matriz de gel un campo eléctrico que cambia periódicamente de dirección. [1] [2] La electroforesis en gel de campo pulsado es un método utilizado para separar grandes segmentos de ADN mediante un campo alterno y cruzado. En un campo magnético uniforme, los componentes de más de 50 kb se mueven a través del gel en forma de zigzag, lo que permite una separación más eficaz de las moléculas de ADN. Este método se utiliza comúnmente en microbiología para tipificar bacterias y es una herramienta valiosa para estudios epidemiológicos y mapeo genético en microbios y células de mamíferos. También jugó un papel en el desarrollo de sistemas de clonación de inserciones grandes, como cromosomas artificiales de bacterias y levaduras . [3]
El PFGE se puede utilizar para determinar la similitud genética entre bacterias, ya que las especies cercanas y similares tendrán perfiles similares, mientras que las diferentes tendrán perfiles diferentes. Esta característica es útil para identificar el agente prevalente de una enfermedad. Además, se puede utilizar para monitorear y evaluar microorganismos en muestras clínicas, suelo y agua. También se considera un método confiable y estándar en la preparación de vacunas. En los últimos años, el PFGE ha sido ampliamente utilizado como una poderosa herramienta para controlar, prevenir y monitorear enfermedades en diferentes poblaciones [3]
El PFGE fue inventado y descrito por DC Schwartz y CR Cantor a principios de los años 1980.
Existen numerosas implementaciones de instrumentación PFGE, como FIGE, TAFE, CHEF, OFAG, PHOGE y PACE, que se utilizan para aislar y tipificar moléculas de ADN grandes. La elección de qué método utilizar depende de los recursos financieros disponibles y de los objetivos específicos del estudio. [4] [5]
Esta es una técnica que separa grandes segmentos de ADN volteando periódicamente dos campos en ángulo recto. El movimiento de las moléculas de ADN se ve facilitado por pulsos más cortos o menos fuerza en la dirección inversa. Este método, introducido por primera vez por Carle, Frank y Olson en 1986, es conocido por su facilidad de uso y popularidad para separar partes más pequeñas de ADN. Proporciona una resolución aceptable de más de 800 Kb. Sin embargo, el movimiento de moléculas de ADN de más de 2 MB puede no ser consistente y moléculas de diferentes tamaños y etiquetas pueden moverse y migrar juntas en la FIGE. [6]
Este sistema es una técnica de laboratorio desarrollada por Schwartz y Cantor en 1984. [4] PFGE utiliza campos eléctricos no uniformes para separar grandes fragmentos de ADN. Esto puede provocar variaciones en la migración del ADN a lo largo del gel, lo que dificulta distinguir y mapear los diferentes componentes del genoma, particularmente en células de mamíferos. El ángulo entre los campos eléctricos puede variar, con un rango entre menos de 180 grados y más de 90 grados. A pesar de esta limitación, todavía se pueden separar moléculas de ADN de entre 1000 kb y 2000 kb mediante este método. [7]
Este es un método para detectar roturas de doble cadena de ADN (DSB) mediante electroforesis en gel de campo asimétrico inverso. La técnica consiste en extraer ADN de las células, fijarlo en tapones de agarosa y transferirlos al sistema AFIGE. Luego se mide la tasa de rotura del ADN bajo un campo eléctrico invertido y asimétrico, lo que permite una medición cuantitativa. Este método implica exponer el ADN a endonucleasas de restricción, como Xhol, durante un período de tiempo más largo, lo que resulta en un aumento en el número de fracturas. Es específico para detectar ADN bicatenario. [8]
Este sistema es un método ampliamente utilizado para la electroforesis en gel de campo pulsado. Fue desarrollado por Clark et al. y crea distorsión en el borde de la cámara y los electrodos pasivos mediante un método complejo. Esto permite el control automático de los electrodos y una disposición hexagonal de 24 electrodos. A diferencia de otros sistemas, CHEF no utiliza electrodos no pasivos y todos los electrodos están conectados a la fuente de alimentación a través de una serie de resistencias anulares idénticas. Estos anillos regulan el voltaje en todos los electrodos, creando un campo eléctrico unitario. El voltaje del sistema CHEF se establece en 24 puntos y utiliza una orientación de ángulo de 120 grados desde el electrodo positivo al electrodo negativo. Este sistema puede separar moléculas de más de 7000 kb de tamaño. La precisión en el control del tamaño, ubicación, coordinación, estabilidad y continuidad del campo eléctrico permite la separación de fragmentos de ADN de diferentes tamaños. [7]
El sistema de electroforesis PACE es un método altamente eficiente y flexible para la separación de ADN. Utiliza 24 electrodos dispuestos en un contorno cerrado y permite un ajuste independiente del voltaje, brindando un control completo sobre todos los parámetros del campo eléctrico. El sistema puede producir un número ilimitado de campos eléctricos homogéneos controlados, gradientes de voltaje, dirección y duración del flujo, lo que lo hace superior a otros métodos como FIGE, OFAG y PHOGE. El sistema PACE puede separar fragmentos de ADN desde 100 pb hasta más de 6 Mb y su capacidad para cambiar el ángulo entre la reorientación de corrientes alternas aumenta la velocidad de separación de moléculas de ADN grandes. Es la mejor opción para una separación de ADN confiable y eficiente. [9]
El método Southern, introducido en 1987, es una técnica utilizada para la separación del ADN. Se trata de girar un gel entre dos ángulos mientras la fuente de alimentación está apagada. El método, también conocido como electroforesis en gel giratorio (RGE), utiliza un campo eléctrico monótono y la separación directa se logra mediante el uso de un único conjunto de electrodos. La rotación del gel permite aplicar una mayor intensidad de voltaje, lo que resulta en un tiempo de aislamiento más corto. Además, el ángulo de rotación se puede ajustar fácilmente para adaptarse a las necesidades específicas de la separación. Este método se considera fácil de usar y es adecuado para ADN con un rango de tamaño de 50 a 6000 Kb. [9]
El método de orientación en ángulo de 90 grados, también conocido como electroforesis en gel de campo ortogonal pulsado homogéneo (PHOGE), se destaca de otros métodos de PFGE que utilizan campos homogéneos. Este sistema utiliza un ángulo de orientación de 90 grados, lo que da como resultado que las moléculas de ADN se muevan cuatro veces por ciclo en lugar de las dos estándar. El uso de múltiples campos eléctricos también hace que las líneas de ADN no sigan una línea recta, lo que hace que este método sea aún más efectivo. Este sistema está diseñado específicamente para separar fragmentos de ADN de más de 1 Mb, lo que lo convierte en una poderosa herramienta para análisis de ADN de mayor tamaño. [10]
El protocolo normalmente implica los siguientes pasos:
El PFGE se puede utilizar para genotipado o toma de huellas genéticas . Durante varias décadas se ha considerado comúnmente un estándar de oro en los estudios epidemiológicos de organismos patógenos. Por ejemplo, la subtipificación de aislados bacterianos con este método ha hecho que sea más fácil discriminar entre cepas de Listeria monocytogenes , Lactococcus garvieae [13] y algunos aislados clínicos del grupo Bacillus cereus [14] aislados de enfermedades de organismos acuáticos y así vincular aislados ambientales o alimentarios. con infecciones clínicas. Ahora está en proceso de ser reemplazado por métodos de secuenciación de próxima generación. [15] De modo que la electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) es una técnica poderosa que se utiliza para analizar genomas bacterianos cuando los métodos genéticos tradicionales no son suficientes. Es particularmente útil para crear mapas estructurales de varios genomas bacterianos dividiéndolos en grandes trozos mediante enzimas de restricción. Luego, estos fragmentos se separan y segregan, lo que permite un análisis detallado del genoma. En otras palabras, PFGE es una técnica avanzada que permite a los científicos obtener una comprensión más profunda de los genomas bacterianos, incluso cuando se enfrentan a preguntas difíciles o complejas. Se ha convertido en un método popular para comprender la estructura de los genomas bacterianos y puede proporcionar información valiosa sobre su comportamiento y características. En resumen, PFGE es un método muy eficaz para analizar genomas bacterianos que permite una comprensión detallada y profunda de su estructura y comportamiento. [dieciséis]
La electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) es una técnica poderosa que se usa ampliamente en microbiología clínica para la caracterización e identificación de patógenos bacterianos. Este método es particularmente útil para tipificar aislados bacterianos a partir de muestras clínicas, como sangre, orina e hisopos de heridas. [17] La capacidad de PFGE para separar grandes fragmentos de ADN, a menudo superiores a 100 kb, permite un alto nivel de resolución y poder discriminatorio. [18]
Una de las aplicaciones más importantes de PFGE en microbiología clínica es la identificación y seguimiento de infecciones nosocomiales, en particular aquellas causadas por bacterias multirresistentes. Por ejemplo, el PFGE se ha utilizado para identificar brotes de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina (MRSA) en hospitales y centros de atención a largo plazo. [19] También se ha utilizado para rastrear la propagación de Enterococcus resistente a la vancomicina (VRE) y Acinetobacter baumannii resistente a múltiples fármacos [20].
Además, el PFGE se ha utilizado para controlar la aparición de resistencia a los antibióticos entre patógenos bacterianos. Por ejemplo, se ha utilizado para rastrear la propagación de la resistencia a los antibióticos mediada por plásmidos entre Escherichia coli y Klebsiella pneumoniae. [21]
Finalmente, el PFGE también se utiliza en la caracterización de patógenos bacterianos asociados con enfermedades transmitidas por alimentos. Por ejemplo, se ha utilizado para identificar brotes de Salmonella y Listeria monocytogenes asociados con productos alimenticios contaminados. [22]
En conclusión, la electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) es una técnica poderosa que se usa ampliamente en microbiología clínica para la caracterización e identificación de patógenos bacterianos, especialmente en infecciones nosocomiales, aparición de resistencia a antibióticos y enfermedades transmitidas por alimentos.