Para farmacología y genética , el Umu Chromotest , desarrollado y publicado por primera vez por Oda et al., [1] es un ensayo biológico ( bioensayo ) para evaluar el potencial genotóxico de compuestos químicos . Se basa en la capacidad de los agentes que dañan el ADN para inducir la expresión del operón umu . En relación con los genes recA, lexA y umuD que inducen daños (din), el gen umuC participa esencialmente en la mutagénesis bacteriana a través de la respuesta SOS .
Esta prueba utiliza una fusión de operones que coloca el operón lac (responsable de producir β-galactosidasa, una proteína que degrada la lactosa) bajo el control de las proteínas relacionadas con umu. Es posible realizar una prueba colorimétrica simple agregando un análogo de lactosa que se degrada por la β-galactosidasa, produciendo un compuesto coloreado que se puede medir cuantitativamente mediante espectrofotometría . El grado de desarrollo del color es una medida indirecta de la β-galactosidasa producida, que a su vez está directamente relacionada con la cantidad de daño en el ADN.
El Umu Chromotest tiene la ventaja añadida de tener su procedimiento codificado según la norma ISO 13829 "Calidad del agua: determinación de la genotoxicidad del agua y de las aguas residuales mediante el umu-test". Aunque la genotoxicidad no puede vincularse directamente con el desarrollo de cáncer en humanos, se ha demostrado que existe una fuerte correlación entre los efectos genotóxicos en las bacterias y sus propiedades mutagénicas e iniciadoras de tumores en los mamíferos. [2] [3]
La bacteria Salmonella typhimurium TA 1535 [pSK 1002] se expone a compuestos de prueba potencialmente genotóxicos en una microplaca de 96 pocillos. Si se producen lesiones genotóxicas en el genoma bacteriano, se induce el gen umuC como parte de la respuesta SOS general . El plásmido pSK1002 contiene el gen umuC fusionado con el gen indicador lacZ, de forma muy similar a la fusión en el SOS Chromotest. La inducción del gen umuC es, por tanto, una medida del potencial genotóxico de la muestra. Dado que el gen umuC está fusionado con el gen lacZ para la β-galactosidasa, la inducción del gen umuC puede evaluarse fácilmente mediante la determinación de la actividad de la β-galactosidasa, medida mediante la conversión de un sustrato ONPG incoloro (o-nitrofenilo). -β-D-galactopiranósido) al producto amarillo o-nitrofenilo por la B-galactosidasa codificada por lacZ. [4]
Como la respuesta SOS es una respuesta general a las lesiones genotóxicas, una cepa de S. typhimurium con la construcción del gen informador apropiado es suficiente para identificar todas las clases de genotoxinas bacterianas. Al igual que con otros ensayos de genotoxicidad y mutagenicidad bacteriana, los compuestos que requieren activación metabólica para su actividad se pueden investigar con la adición de extracto microsomal de hígado de rata S9.
Las bacterias S. typhimurium en la fase exponencial de crecimiento se exponen durante 2 horas a concentraciones decrecientes de la muestra problema por triplicado, incluidos los controles positivos y negativos, así como los blancos. Después de 2 horas, los cultivos de exposición se diluyen en medios de crecimiento nuevos y se dejan crecer durante 2 horas más. La inducción del gen umuC y el gen indicador lacZ fusionado y la posterior expresión de β-galactosidasa se evalúan después de la lisis de la bacteria. El ONPG incoloro se convierte en el producto amarillo o-nitrofenilo en presencia de la β-galactosidasa inducida. La intensidad del color se correlaciona con la cantidad de proteína inducida y, por tanto, con la potencia genotóxica de la muestra de prueba.
Se utilizan métricas cuantitativas, leyéndose la absorbancia de la placa a OD600 antes y después de la fase de crecimiento, así como a la OD420 después de la incubación con ONPG. Esto permite calcular la relación de inducción (IR), así como el factor de crecimiento para determinar si la citotoxicidad también está presente e invalida los valores de IR. [5]
La alta correlación entre el Umu Chromotest y la prueba tradicional de Ames para determinar mutagenicidad lo respalda como una alternativa razonable para las pruebas en etapa inicial de los miles de nuevos productos químicos farmacéuticos, agrícolas e industriales que se sintetizan cada año. La mayoría de los grandes fabricantes de productos químicos tienen la capacidad de detectar 100 o más productos químicos sintéticos por año con la prueba tradicional de Ames, que requiere el uso de varias cepas de Salmonella. La prueba umu, que utiliza una sola cepa de Salmonella, podría potencialmente probar una gama más amplia de nuevas sustancias químicas con los mismos recursos. La reducción de gasto en material y mano de obra, así como su robustez, también lo posicionan como una pantalla adecuada para muestras ambientales complejas. [6]
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