La cristalografía resuelta en el tiempo utiliza imágenes de cristalografía de rayos X para visualizar reacciones en cuatro dimensiones (x, y, z y tiempo). Esto permite estudiar los cambios dinámicos que se producen, por ejemplo, en las enzimas durante su catálisis. La dimensión temporal se incorpora desencadenando la reacción de interés en el cristal antes de la exposición a los rayos X y luego recopilando los patrones de difracción en diferentes retrasos temporales. Para estudiar estas propiedades dinámicas de las macromoléculas se deben cumplir tres criterios; [1]
Esto ha llevado al desarrollo de varias técnicas que se pueden dividir en dos grupos, el método de bomba-sonda y los métodos de captura por difusión.
En el método de bomba-sonda, la reacción primero se desencadena (bomba) mediante fotólisis (normalmente luz láser) y luego se recoge un patrón de difracción mediante un pulso de rayos X (sonda) con un retardo de tiempo específico. Esto hace posible obtener muchas imágenes en diferentes tiempos después del desencadenamiento de la reacción y construir así una serie cronológica de imágenes que describen los eventos durante la reacción. Para obtener una relación señal/ruido razonable, este ciclo de bomba-sonda debe realizarse muchas veces para cada rotación espacial del cristal, y muchas veces para el mismo retardo de tiempo. Por lo tanto, la reacción que se desea estudiar con la bomba-sonda debe poder relajarse y recuperar su conformación original después de la activación, lo que permite realizar muchas mediciones en la misma muestra. La resolución temporal de los fenómenos observados está dictada por la duración del pulso de sondeo ( ancho total a la mitad del máximo ). Todos los procesos que ocurren en una escala de tiempo más rápida serán promediados por la convolución de la intensidad del pulso de la sonda en el tiempo con la intensidad de la reflectividad de rayos X real de la muestra.
Los métodos de captura por difusión utilizan técnicas de difusión para introducir los sustratos en el cristal y luego se aplican diferentes técnicas de captura para lograr que el intermedio de interés se acumule en el cristal antes de la recolección del patrón de difracción. Estos métodos de captura podrían implicar cambios en el pH , [2] el uso de inhibidores [3] o bajar la temperatura para ralentizar la tasa de recambio o tal vez incluso detener la reacción por completo en un paso específico. También es un método posible simplemente iniciar la reacción y luego congelarla instantáneamente [4] , extinguiéndola así en un paso de tiempo específico. Un inconveniente de los métodos de captura por difusión es que solo se pueden utilizar para estudiar intermedios que pueden quedar atrapados, lo que limita la resolución temporal que se puede obtener a través de los métodos en comparación con el método de bomba-sonda.