En microscopía de fluorescencia , la colocalización se refiere a la observación de la superposición espacial entre dos (o más) etiquetas fluorescentes diferentes, cada una con una longitud de onda de emisión separada, para ver si los diferentes "objetivos" están ubicados en la misma área de la célula o muy cerca de ella. unos y otros. La definición se puede dividir en dos fenómenos diferentes, coocurrencia, que se refiere a la presencia de dos fluoróforos (posiblemente no relacionados) en el mismo píxel, y correlación, una relación estadística mucho más significativa entre los fluoróforos indicativa de una interacción biológica. [1] Esta técnica es importante para muchos estudios biológicos y fisiológicos celulares durante la demostración de una relación entre pares de biomoléculas.
La capacidad de demostrar una correlación entre un par de biomoléculas fue mejorada en gran medida por Erik Manders de la Universidad de Amsterdam, quien presentó el coeficiente de correlación de Pearson (PCC) a los microscopistas, [2] junto con otros coeficientes de los cuales los "coeficientes de superposición" M1 y M2 han demostrado ser los más populares y útiles. [3] [4] El propósito de utilizar coeficientes es caracterizar el grado de superposición entre imágenes, generalmente dos canales en una imagen de microscopía multidimensional grabada en diferentes longitudes de onda de emisión. Sylvain Costes introdujo un enfoque popular, quien utilizó el coeficiente de correlación de Pearson como herramienta para establecer los umbrales requeridos por M1 y M2 de manera objetiva. [5] El enfoque de Costes parte del supuesto de que sólo las correlaciones positivas son de interés y no proporciona una medición útil del PCC.
Aunque el uso de coeficientes puede mejorar significativamente la confiabilidad de la detección de colocalización, depende de una cantidad de factores, incluidas las condiciones de cómo se prepararon las muestras con fluorescencia y cómo se adquirieron y procesaron las imágenes con colocalización. Los estudios deben realizarse con gran precaución y después de una cuidadosa lectura de antecedentes. Actualmente, el campo está plagado de confusión y aún no se ha establecido firmemente un enfoque estandarizado. [6] Los intentos de rectificar esto incluyen un nuevo examen y revisión de algunos de los coeficientes, [7] [8] la aplicación de un factor para corregir el ruido, [1] "Correlaciones corregidas por ruido basadas en réplicas para mediciones precisas de colocalización". [9] y la propuesta de protocolos adicionales, [10] que fueron revisados minuciosamente por Bolte y Cordelieres (2006). [6] Además, debido a la tendencia de las imágenes de fluorescencia a contener una cierta cantidad de señal desenfocada, disparos de Poisson y otros ruidos, generalmente requieren un procesamiento previo antes de la cuantificación. [11] [12] La restauración cuidadosa de la imagen mediante deconvolución elimina el ruido y aumenta el contraste de las imágenes, mejorando la calidad de los resultados del análisis de colocalización. Hasta ahora, los métodos más utilizados para cuantificar la colocalización calculan la correlación estadística de las intensidades de los píxeles en dos canales de microscopía distintos. Estudios más recientes han demostrado que esto puede conducir a coeficientes de correlación elevados incluso para objetivos que se sabe que residen en diferentes compartimentos celulares. [13] Se puede lograr una cuantificación más sólida de la colocalización combinando el reconocimiento de objetos digitales, el cálculo de la superposición del área y la combinación con un valor de correlación de intensidad de píxeles. Esto llevó al concepto de coeficiente de correlación de Pearson corregido por objeto. [13]
Algunos tintes de zinc fluorescentes impermeables pueden marcar de manera detectable el citosol y los núcleos de las células apoptizantes y necrotizantes entre cada uno de los cuatro tipos de tejidos diferentes examinados. A saber: la corteza cerebral , el hipocampo , el cerebelo , y también se demostró que la detección colocalizada de aumento de zinc y el bien aceptado indicador de muerte celular yoduro de propidio también se produjo en las células renales. Utilizando los principios de colocalización fluorescente. Se demostró la detección coincidente de la acumulación de zinc y la absorción de yoduro de propidio (un indicador tradicional de muerte celular) en múltiples tipos de células. [14] En una revisión se pueden encontrar varios ejemplos de cuantificación de la colocalización en el campo de la neurociencia. [15] Los protocolos detallados sobre la cuantificación de la colocalización se pueden encontrar en un capítulo de libro. [dieciséis]
La colocalización se utiliza en microscopía de fluorescencia de una sola molécula en tiempo real para detectar interacciones entre especies moleculares marcadas con fluorescencia. En este caso, una especie (por ejemplo, una molécula de ADN) normalmente se inmoviliza en la superficie de formación de imágenes y la otra especie (por ejemplo, una proteína de unión al ADN) se suministra a la solución. Las dos especies están marcadas con tintes de colores espectralmente resueltos (>50 nm), por ejemplo, cianina-3 y cianina-5. La excitación por fluorescencia normalmente se lleva a cabo en modo de reflexión interna total, lo que aumenta la relación señal-ruido de las moléculas en la superficie con respecto a las moléculas en la solución a granel. Las moléculas se detectan como puntos que aparecen en la superficie en tiempo real, y sus ubicaciones se encuentran dentro de 10 a 20 nm mediante el ajuste de funciones de dispersión de puntos. Dado que los tamaños típicos de las biomoléculas son del orden de 10 nm, esta precisión suele ser suficiente para determinar las interacciones moleculares [17]
Con el fin de interpretar mejor los resultados de los estudios de colocalización cualitativos y cuantitativos, se sugirió utilizar un conjunto de cinco variables lingüísticas vinculadas a los valores de los coeficientes de colocalización, como muy débil , débil , moderado , fuerte y muy fuerte . por describirlos. El enfoque se basa en el uso del modelo de sistema difuso y simulación por computadora. Cuando se introducen nuevos coeficientes, sus valores se pueden ajustar al conjunto. [18]
El grado de colocalización en imágenes de microscopía de fluorescencia se puede validar utilizando Colocalization Benchmark Source , una colección gratuita de conjuntos de imágenes descargables con valores predefinidos de colocalización.