El método ChIA-PET combina métodos basados en ChIP, [2] y métodos basados en captura de conformación cromosómica (3C), [3] para ampliar las capacidades de ambos enfoques. ChIP-Sequencing (ChIP-Seq) es un método popular utilizado para identificar sitios de unión de factores de transcripción (TFBS), mientras que 3C se ha utilizado para identificar interacciones de cromatina de largo alcance. Independientemente, ambos sufren limitaciones en la identificación de interacciones de novo de largo alcance en todo el genoma. Si bien ChIP-Seq puede identificar TFBS en todo el genoma, [4] [5] proporciona solo información lineal de los sitios de unión de proteínas a lo largo de los cromosomas (pero no interacciones entre ellos), y puede sufrir un alto ruido de fondo genómico (falsos positivos). Si bien 3C es capaz de analizar interacciones de cromatina de largo alcance no lineales, no se puede utilizar en todo el genoma y, al igual que ChIP-Seq, también sufre altos niveles de ruido de fondo. Dado que el ruido aumenta en relación con la distancia entre las regiones interactuantes (máximo 100 kb), se requieren controles laboriosos y tediosos para la caracterización precisa de las interacciones de la cromatina. [6] A diferencia de 3C, que es un método de perfil de interacción específico de locus, se han establecido métodos alternativos como Hi-C para perfilar las interacciones de todo el genoma. [7] A pesar de los métodos de perfil de genoma completo tanto para TFBS como para interacciones de largo alcance, la combinación de enfoques con el método ChIA-PET permite la identificación de áreas genómicas en las que se une la proteína de interés, así como la región genómica con la que interactúa. [8] [9]
El método ChIA-PET resuelve con éxito los problemas de ruido de interacción no específico encontrado en ChIP-Seq mediante la sonicación de los fragmentos de ChIP para separar las uniones aleatorias de los complejos de interacción específicos. El siguiente paso, que se conoce como enriquecimiento, reduce la complejidad para el análisis de todo el genoma y agrega especificidad a las interacciones de la cromatina unidas por TF (factores de transcripción) predeterminados. La capacidad de los enfoques 3C para identificar interacciones de largo alcance se basa en la teoría de la ligadura de proximidad. Con respecto a la interligación del ADN, los fragmentos que están unidos por complejos proteicos comunes tienen mayores ventajas cinéticas en condiciones diluidas, que aquellos que se difunden libremente en solución o están anclados en diferentes complejos. ChIA-PET aprovecha este concepto al incorporar secuencias de enlace en los extremos libres de los fragmentos de ADN unidos a los complejos proteicos. Para generar conectividad de los fragmentos unidos por complejos reguladores, las secuencias de enlace se ligan durante la ligadura de proximidad nuclear. Por lo tanto, los productos de la ligadura conectada al enlazador se pueden analizar mediante secuenciación PET de ultra alto rendimiento y mapearlos al genoma de referencia . Dado que ChIA-PET no depende de sitios específicos para la detección como lo son 3C y 4C, permite la detección de novo imparcial de interacciones de cromatina en todo el genoma. [8] En comparación con Hi-C, el uso de un pulldown de anticuerpos limita el número de fragmentos secuenciados a interacciones de cromatina unidas por la proteína de interés, lo que también puede facilitar el análisis de datos.
Flujo de trabajo
Parte del flujo de trabajo correspondiente al laboratorio húmedo:
Figura 1. Se presentan los enlaces universales biotinilados con sitios de endonucleasa de restricción Mme1.Figura 2. Los enlaces universales biotinilados se ligan a los extremos libres del ADN.Figura 3. Ligadura de enlaces durante la ligadura de proximidad.Figura 4. Extracción de enlaces biotinilados mediante perlas de estreptavidina y amplificación de etiquetas de ADN.Figura 5. Conformaciones de los enlaces universales.
El formaldehído se utiliza para reticular los complejos de ADN y proteína. La sonicación se utiliza para romper la cromatina y también para reducir las interacciones no específicas.
Se utiliza un anticuerpo específico de elección para enriquecer los fragmentos de cromatina unidos a la proteína de interés. El material ChIP unido al anticuerpo se utiliza para construir la ChIA-PET.
Figura 1. Se utilizan semienlazadores de oligonucleótidos biotinilados que contienen sitios MmeI flanqueantes para conectar fragmentos de ADN ligados por proximidad. Se diseñan dos enlazadores diferentes (A y B) con códigos de barras de nucleótidos específicos (CG o AT) para cada una de las dos secuencias de enlazadores (esto permitirá la identificación del producto de ligamiento quimérico como se describe en la Figura 5).
Figura 2. Los enlazadores están ligados a los fragmentos de ADN anclados.
Figura 3. Los fragmentos de enlace se ligan a las perlas ChIP en condiciones diluidas. A continuación, el ADN purificado se digiere con MmeI, que corta a distancia de su sitio de reconocimiento para liberar la estructura etiqueta-enlazador-etiqueta.
Figura 4. Los PET biotinilados se inmovilizan luego en perlas magnéticas conjugadas con estreptavidina.
Figura 5. Las secuencias PET con composición de código de barras de enlace AA (CG/CG) y BB (AT/AT) se consideran posibles productos de ligadura intracomplejo, mientras que las secuencias PET con composición de enlace AB (CG/AT) se consideran derivadas de productos de ligadura quiméricos entre fragmentos de ADN unidos en diferentes complejos de cromatina.
Parte del flujo de trabajo en laboratorio seco:
Extracción, mapeo y análisis estadísticos de PET
Las etiquetas PET se extraen y se asignan al genoma humano de referencia in silico .
Identificación de picos enriquecidos con ChIP (sitios de unión)
Las PET autoligadas se utilizan para identificar sitios enriquecidos con ChIP porque proporcionan el mapeo más confiable (20 + 20 bit/s) al genoma de referencia.
Algoritmo de búsqueda de picos de enriquecimiento de ChIP
Un pico llamado se considera un sitio de unión si hay múltiples PET autoligados superpuestos. La tasa de descubrimiento falso (FDR) se determina utilizando simulaciones estadísticas para estimar el fondo aleatorio de las superposiciones de ADN virtual derivadas de PET y el ruido de fondo estimado.
Filtrado de ADN repetitivo (afecta la unión no específica)
Se eliminan las regiones satélite y los sitios de unión presentes en regiones con variaciones estructurales graves.
Recuento de enriquecimiento de ChIP
Se informan las cantidades de PET autoligadas e interligadas en cada sitio (dentro de una ventana de +250 pb). La cantidad total de PET autoligadas e interligadas en un sitio específico se denomina recuento de enriquecimiento de ChIP.
Figura 6. Clasificación PET: Las secuencias PET alineadas de forma única se pueden clasificar según se deriven de un fragmento de ADN o de dos fragmentos de ADN.
Figura 6. Las PET intra e interligadas se agrupan alrededor de TFBS cuando se asignan al genoma humano de referencia.
PET de autoligado
Si las dos etiquetas de una PET están mapeadas en el mismo cromosoma con el lapso genómico en el rango de fragmentos de ADN de ChIP (menos de 3 Kb), con la orientación de autoligación esperada y en la misma cadena, se considera que se derivan de una autoligación de un solo fragmento de ADN de ChIP y se consideran una PET de autoligación.
PET interligación
Si una PET no cumple con estos criterios, lo más probable es que haya sido el resultado de un producto de ligadura entre dos fragmentos de ADN y se la denomina PET de interligación. Las dos etiquetas de una PET de interligación no tienen orientaciones de etiquetas fijas, es posible que no se encuentren en las mismas cadenas, que tengan cualquier extensión genómica y que no se correspondan con el mismo cromosoma.
PET de interligación intracromosómica
Si las dos etiquetas de una PET de interligación están mapeadas en el mismo cromosoma pero con una distancia > 3 Kb en cualquier orientación, entonces estas PET se denominan PET de interligación intracromosómica.
PET de interligación intercromosómica
Las PET que se asignan a diferentes cromosomas se denominan PET de interligación intercromosómica.
Figura 7. Mecanismo propuesto que muestra cómo los elementos reguladores distales pueden iniciar interacciones de cromatina de largo alcance que involucran regiones promotoras de genes objetivo.
Figura 7. Mecanismo de bucle de ADN propuesto entre las proteínas reguladoras distales y la región promotora
Las interacciones forman estructuras de bucle de ADN con múltiples TFBS en el centro de anclaje. Los bucles pequeños podrían empaquetar genes cerca del centro de anclaje en un subcompartimento estrecho, lo que podría aumentar la concentración local de proteínas reguladoras para una mayor activación transcripcional. Este mecanismo también podría mejorar la eficiencia de la transcripción, permitiendo que la ARN polimerasa II realice ciclos en las plantillas de genes circulares estrechas. Los bucles de interacción grandes tienen más probabilidades de unir genes distantes en cada extremo del bucle que residen cerca de los sitios de anclaje para una regulación coordinada, o podrían separar genes en bucles largos para evitar su activación. Adaptado de Fullwood et al. (2009).
Fortalezas y debilidades
Ventajas del método ChIA-PET
La ChIA-PET tiene el potencial de ser un enfoque imparcial, de genoma completo y de novo para el análisis de la interacción de la cromatina a largo plazo (Fullwood y Yijun, 2009).
Un experimento ChIA-PET es capaz de proporcionar dos conjuntos de datos globales: los sitios de unión del factor proteico (PET autoligados) y las interacciones entre los sitios de unión (PET interligados).
ChIA-PET implica ChIP para reducir la complejidad del análisis de todo el genoma y agrega especificidad a las interacciones de la cromatina unidas por factores específicos de interés.
ChIA-PET es compatible con enfoques de secuenciación de próxima generación basados en etiquetas, como la pirosecuenciación Roche 454, Illumina GA, ABI SOLiD y Helicos.
La ChIA-PET es aplicable a muchos factores proteicos diferentes implicados en la regulación transcripcional o en la conformación estructural de la cromatina.
El análisis ChIA-PET se puede aplicar a las interacciones de la cromatina implicadas en un proceso nuclear particular. Mediante el uso de factores de transcripción generales, como la ARN polimerasa II, es posible identificar todas las interacciones de la cromatina implicadas en la regulación de la transcripción. Además, el uso de factores proteicos implicados en la replicación del ADN o la estructura de la cromatina permitiría la identificación de todas las interacciones debidas a la replicación del ADN y la modificación estructural de la cromatina (Fullwood et al., 2009).
Debilidades
Está bien establecido que los complejos reguladores cis y trans contienen combinaciones únicas de proteínas según las condiciones específicas de las células y los tejidos (Dekker et al., 2006). Si bien la identificación de un único TFBS funcional es un avance significativo, el uso de ChIA-PET para identificar proteínas individuales en un complejo requeriría conjeturas y múltiples experimentos para identificar cada proteína interactuante. Esto sería un esfuerzo costoso y que demandaría mucho tiempo.
La ChIA-PET está limitada por la calidad, pureza y especificidad de los anticuerpos utilizados (Fullwood et al., 2009).
La ChIA-PET depende de la identificación de secuencias que puedan asignarse a la secuencia de referencia (ref).
La técnica ChIA-PET requiere el uso de algoritmos informáticos de reconocimiento de picos para organizar y mapear las lecturas PET al genoma de referencia. Debido a las variaciones entre las plataformas de software, los resultados pueden variar según el programa que se utilice.
Aunque las regiones de ADN repetitivas pueden asociarse con la regulación genética (Polak y Domany, 2006), es necesario eliminarlas ya que pueden afectar los datos (Fullwood et al., 2009).
El enriquecimiento de dos sitios simultáneamente introduce un sesgo contra las regiones circundantes. [10]
Historia
Fullwood et al. (2009) utilizaron la técnica ChIA-PET para detectar y mapear la red de interacción de la cromatina mediada por el receptor de estrógeno alfa (ER-alfa) en células cancerosas humanas. El mapa global del interactoma de la cromatina resultante reveló que los sitios de unión remotos del ER-alfa también estaban anclados a promotores genéticos a través de interacciones de cromatina de largo alcance, lo que sugiere que el ER-alfa funciona mediante un extenso bucle de cromatina para unir genes para una regulación transcripcional coordinada.
Análisis y software
Alternativas
Inmunoprecipitación de cromatina (ChIP):
Técnicas de conformación cromosómica
El método ChIP original es una tecnología basada en anticuerpos que identifica y se une a las proteínas de forma selectiva para ofrecer información sobre los estados de la cromatina y la transcripción genética .[17]
Mapeo de la arquitectura del genoma (GAM):
Esta técnica elimina una serie de inconvenientes asociados con las técnicas basadas en 3C al recopilar proximidades tridimensionales entre cualquier número de loci genómicos . [12]
Reconocimiento de interacciones mediante extensión de etiquetas (SPRITE) en grupos divididos
SPRITE es una técnica para mapear interacciones de orden superior en el núcleo a lo largo del genoma. Este enfoque detecta interacciones que ocurren en distancias espaciales mayores y permite la detección en todo el genoma de numerosas interacciones de ARN y ADN que ocurren al mismo tiempo. [13]
Gota de ChIA
ChIA-Drop es un método sencillo para analizar interacciones de cromatina multiplex utilizando secuenciación basada en gotas y vinculada a códigos de barras con precisión de molécula única. Los enfoques anteriores a nivel de población por pares, como Hi-C y ChIA-PET, son distintos de esta tecnología. [14] [15]
Referencias
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Enlaces externos
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