Minflujo

MINFLUX , o microscopía mínima de flujos de fotones de fluorescencia, es un método de microscopía óptica de súper resolución que captura imágenes y rastrea objetos en dos y tres dimensiones con una resolución nanométrica de un solo dígito. ^[1]^[2]^[3]

MINFLUX utiliza un haz de excitación estructurado con al menos una intensidad mínima (normalmente un haz en forma de rosquilla con una intensidad central cero) para provocar la emisión de fotones de un fluoróforo. La posición del haz de excitación se controla con precisión subnanométrica y cuando la intensidad cero se coloca exactamente en el fluoróforo, el sistema no registra ninguna emisión. Por tanto, el sistema requiere pocos fotones emitidos para determinar la ubicación del fluoróforo con alta precisión. En la práctica, superponer la intensidad cero y el fluoróforo requeriría un conocimiento de ubicación a priori para posicionar el haz. Como este no es el caso, el haz de excitación se mueve siguiendo un patrón definido para sondear la emisión del fluoróforo cerca del mínimo de intensidad. ^[1]

Cada localización tarda menos de 5 microsegundos, ^[1] por lo que MINFLUX puede construir imágenes de estructuras nanométricas o rastrear moléculas individuales en muestras fijas y vivas agrupando las ubicaciones de etiquetas fluorescentes. Dado que el objetivo es localizar el punto donde un fluoróforo deja de emitir, MINFLUX reduce significativamente la cantidad de fotones de fluorescencia necesarios para la localización en comparación con otros métodos. ^[2]^[4]

Abberior Instruments GmbH ofrece un sistema MINFLUX comercial. ^[5]

Principio

MINFLUX supera el límite de difracción de Abbe en microscopía óptica y distingue moléculas fluorescentes individuales aprovechando las propiedades fotofísicas de los fluoróforos. El sistema silencia temporalmente (pone en estado APAGADO) todas las moléculas menos una dentro de un área limitada por difracción (DLA) y luego localiza esa única molécula activa (en estado ENCENDIDO). ^[1] Las técnicas de microscopía de superresolución como la microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM) y la microscopía de localización fotoactivada (PALM) hacen lo mismo. ^[6] Sin embargo, MINFLUX difiere en cómo determina la ubicación de la molécula.

El haz de excitación utilizado en MINFLUX tiene una intensidad local mínima o intensidad cero. La posición de este cero de intensidad en una muestra se ajusta mediante dispositivos electrónicos de control y actuadores con precisión espacial subnanométrica y temporal submicrosegundo. Cuando la molécula activa ubicada en está en un área de intensidad distinta de cero del haz de excitación, emite fluorescencia. El número de fotones emitidos por la molécula activa es proporcional a la intensidad del haz de excitación en esa posición. ${\vec {r}}_{m}$ $n$

En las proximidades de la intensidad cero del haz de excitación, la intensidad de la emisión de la molécula activa cuando la intensidad cero está situada en la posición puede aproximarse mediante una función cuadrática. Por tanto, el número registrado de fotones de emisión es: $I$ ${\vec {r}}$

$n({\vec {r}},{\vec {r}}_{m})=cI=c({\vec {r}}-{\vec {r}}_{m})^{2}$

donde es una medida de la eficiencia de detección de recolección, la sección transversal de absorción del emisor y el rendimiento cuántico de fluorescencia. $c$

En otras palabras, los flujos de fotones emitidos por la molécula activa cuando se encuentra cerca del punto de intensidad cero del haz de excitación transportan información sobre su distancia al centro del haz. Esa información se puede utilizar para encontrar la posición de la molécula activa. La posición se palpa con un conjunto de intensidades de excitación . Por ejemplo, la molécula activa se excita con el mismo haz en forma de rosquilla movido a diferentes posiciones. El sondeo da como resultado un conjunto correspondiente de recuentos de fotones . Estos recuentos de fotones son probabilísticos; Cada vez que se mide un conjunto de este tipo, el resultado es una realización diferente de los números de fotones que fluctúan alrededor de un valor medio. Dado que su distribución sigue la estadística de Poisson, la posición esperada de la molécula activa se puede estimar a partir del número de fotones, utilizando, por ejemplo, una estimación de máxima verosimilitud de la forma: $K$ $\{I_{0},...,I_{K-1}\}$ $\{n_{0},...,n_{K-1}\}$

${\widehat {{\vec {r}}_{m}}}=argmax{\mathcal {L}}({\vec {r}}\mid \{n_{0},...,n_{K-1}\})$

La posición maximiza la probabilidad de que el conjunto medido de recuentos de fotones se produzca exactamente como se registró y, por lo tanto, es una estimación de la ubicación de la molécula activa. ^[7] ${\widehat {{\vec {r}}_{m}}}$

Proceso de localización

Se necesitan registros de la molécula activa emisora en dos posiciones diferentes del haz de excitación para utilizar la aproximación cuadrática en el principio básico unidimensional descrito anteriormente. Cada grabación proporciona un valor de distancia unidimensional al centro del haz de excitación. En dos dimensiones, se necesitan al menos tres puntos de grabación para determinar una ubicación que pueda usarse para mover el haz de excitación MINFLUX hacia la molécula objetivo. Estos puntos de registro delimitan una zona de sondeo L. Balzarotti et al. ^[1] utilizan el límite de Cramér-Rao para mostrar que restringir esta área de sondeo mejora significativamente la precisión de la localización, más que aumentar el número de fotones emitidos:

$\sigma _{B}\propto {\frac {L}{\sqrt {N}}}$

donde es el límite de Cramér-Rao, es el diámetro del área de sondeo y es el número de fotones emitidos. $\sigma _{B}$ $L$ $N$

MINFLUX aprovecha esta característica al localizar un fluoróforo activo. Registra los flujos de fotones utilizando un esquema de sondeo de al menos tres puntos de registro alrededor del área de sondeo y un punto en el centro. Estos flujos difieren en cada punto de registro ya que la molécula activa se excita con diferentes intensidades de luz. Esos patrones de flujo informan el reposicionamiento del área de sondaje para centrarse en la molécula activa. Luego se repite el proceso de sondeo. Con cada iteración de sondeo, MINFLUX restringe el área de sondeo , estrechando el espacio donde se puede ubicar la molécula activa. Así, la distancia restante entre la intensidad cero y la molécula activa se determina con mayor precisión en cada iteración. La información posicional en constante mejora minimiza la cantidad de fotones de fluorescencia y el tiempo que MINFLUX necesita para lograr localizaciones precisas. ^[8] $L$ $L$

Aplicaciones

Al combinar las ubicaciones determinadas de múltiples moléculas fluorescentes en una muestra, MINFLUX genera imágenes de estructuras nanoscópicas con una resolución de 1 a 3 nm. ^[9] MINFLUX se ha utilizado para obtener imágenes de origami de ADN ^[1]^[10] y del complejo de poros nucleares ^[11] y para dilucidar la arquitectura de las estructuras subcelulares en las mitocondrias y los fotorreceptores. ^[12]^[13] Debido a que MINFLUX no recolecta grandes cantidades de fotones emitidos por las moléculas objetivo, la localización es más rápida que con los sistemas convencionales basados en cámaras. ^[14] Por lo tanto, MINFLUX puede localizar iterativamente la misma molécula a intervalos de microsegundos durante un período definido. MINFLUX se ha utilizado para rastrear el movimiento de la proteína motora kinesina-1, tanto in vitro como in vivo , ^[15]^[16] y para monitorear los cambios de configuración del canal iónico mecanosensible PIEZO1. ^[17]

Ver también

Referencias

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