En química , la prueba de Biuret ( IPA : /ˌbɪjəˈrɛt/, /ˈbɪjəˌrɛt / [ 1 ] ) , también conocida como prueba de Piotrowski , es una prueba química utilizada para detectar la presencia de al menos dos enlaces peptídicos en una molécula . En presencia de péptidos, un ion cobre ( II) forma complejos de coordinación de color malva en una solución alcalina . La reacción se observó por primera vez en 1833; [2] En Polonia , la prueba de Biuret también se conoce como prueba de Piotrowski en honor al fisiólogo polaco Gustaw Piotrowski quien la redescubrió de forma independiente en 1857. [3] Se han desarrollado varias variantes de la prueba, como la prueba BCA y la prueba de Lowry modificada. [4]
La reacción de biuret se puede utilizar para evaluar la concentración de proteínas porque los enlaces peptídicos se producen con la misma frecuencia por aminoácido en el péptido. La intensidad del color, y por lo tanto la absorción a 540 nm, es directamente proporcional a la concentración de proteínas, según la ley de Beer-Lambert .
A pesar de su nombre, el reactivo no contiene biuret [(H 2 N−CO−) 2 NH] . La prueba se llama así porque también da una reacción positiva a los enlaces tipo péptido en la molécula de biuret.
En este ensayo, el cobre (II) se une a los átomos de nitrógeno presentes en los péptidos de las proteínas. En una reacción secundaria, el cobre (II) se reduce a cobre (I). Los tampones, como el Tris y el amoníaco, interfieren con este ensayo, por lo que lo hacen inadecuado para muestras de proteínas purificadas a partir de la precipitación con sulfato de amonio. Debido a su insensibilidad y a la poca interferencia de los aminoácidos libres, este ensayo es más útil para muestras de tejido completo y otras fuentes con alta concentración de proteínas. [5]
Una muestra acuosa se trata con un volumen igual de una base fuerte al 1% (hidróxido de sodio o potasio) seguida de unas gotas de sulfato de cobre(II) acuoso . Si la solución se torna violeta, contiene proteínas. Se pueden determinar entre 5 y 160 mg/ mL . Se necesitan péptidos con la longitud correcta de al menos 3 aminoácidos para un cambio de color significativo y medible con estos reactivos. [6]
El reactivo de biuret está compuesto de hidróxido de sodio (NaOH) y sulfato de cobre (II) hidratado , junto con tartrato de sodio y potasio , [7] este último se agrega para quelar y, por lo tanto, estabilizar los iones cúpricos. La reacción de los iones cúpricos con los átomos de nitrógeno involucrados en los enlaces peptídicos conduce al desplazamiento de los átomos de hidrógeno del péptido en condiciones alcalinas. Una quelación tri- o tetradentada con el nitrógeno del péptido produce el color característico. Esto se encuentra en los dipéptidos. [8]
El reactivo se utiliza comúnmente en el ensayo de proteína biuret , una prueba colorimétrica utilizada para determinar la concentración de proteína mediante espectroscopia UV/VIS a una longitud de onda de 540 nm.
En el análisis colorimétrico moderno de péptidos se aplican habitualmente dos modificaciones importantes de la prueba del biuret: el ensayo del ácido bicinconínico (BCA) y el ensayo de Lowry. En estas pruebas, el Cu + formado durante la reacción del biuret reacciona posteriormente con otros reactivos, lo que da lugar a un color más intenso.
En la prueba BCA , Cu + forma un complejo de color púrpura intenso con el ácido bicinconínico (BCA), [9] que absorbe alrededor de 562 nm, produciendo el color malva característico. El complejo BCA/cobre soluble en agua absorbe mucho más fuertemente que el complejo péptido/cobre, aumentando la sensibilidad de la prueba de biuret en un factor de alrededor de 100: el ensayo BCA permite detectar proteínas en el rango de 0,0005 a 2 mg/mL. Además, el ensayo de proteínas BCA brinda el importante beneficio de la compatibilidad con sustancias como hasta un 5% de surfactantes en muestras de proteínas.
En el ensayo de proteínas de Lowry , el Cu + se oxida nuevamente a Cu2 + por acción del Mo VI en el reactivo de Folin-Ciocalteu , que forma azul de molibdeno (Mo IV ). Los residuos de tirosina en la proteína también forman azul de molibdeno en estas circunstancias. De esta manera, las proteínas se pueden detectar en concentraciones entre 0,005 y 2 mg/mL. [10] El azul de molibdeno puede, a su vez, unirse a ciertos colorantes orgánicos como el verde malaquita y la auramina O , lo que resulta en una mayor amplificación de la señal. [11]
