El ADN genómico de interés se trata con bisulfito de sodio , que introduce diferencias en la secuencia dependientes de la metilación. Durante el tratamiento con bisulfito de sodio, los residuos de citosina no metilados se convierten en uracilo , mientras que los residuos de citosina metilados no se ven afectados.
El paso de cuantificación final de COBRA, donde los niveles de metilación del ADN de la muestra de entrada original se pueden determinar comparando y cuantificando el número de fragmentos digeridos y no digeridos.
El ADN tratado con bisulfito se amplifica mediante PCR, lo que da como resultado residuos de citosina en posiciones originalmente metiladas y residuos de timina en posiciones originalmente no metiladas (que se convirtieron en uracilo). Los cebadores utilizados durante este paso no contienen sitios CpG (el objetivo común de la metilación de la citosina), por lo que el proceso de amplificación no discrimina entre plantillas en función del estado de metilación. Los productos de PCR se purifican para garantizar una digestión completa en el siguiente paso.
Resumen de restricciones
Los pasos anteriores conducen a la retención o pérdida dependiente de la metilación de los sitios de enzimas de restricción que contienen CpG , como los de TaqI (TCGA) y BstUI (CGCG), dependiendo de si el residuo de citosina estaba originalmente metilado o no, respectivamente. Debido a la amplificación independiente de la metilación en el paso anterior, los productos de PCR resultantes serán una población mixta de fragmentos que han perdido o retenido sitios de enzimas de restricción que contienen CpG, cuyos respectivos porcentajes estarán directamente correlacionados con el nivel original de metilación del ADN en la muestra de ADN.
Los productos de PCR se tratan luego con una enzima de restricción ( por ejemplo, BstUI), que solo escindirá los sitios que originalmente estaban metilados (CGCG), mientras que dejará los sitios que originalmente no estaban metilados (TGTG). Para garantizar que se conserven todos los sitios CpG debido a que originalmente estaban metilados, y no un remanente de una conversión incompleta con bisulfito, se realiza una digestión de control, con enzimas como Hsp92II que reconoce la secuencia CATG, ninguna de las cuales debería quedar después de la conversión con bisulfito (con la rara excepción de la metilación no CpG) y, por lo tanto, no debería ocurrir ninguna escisión si la conversión con bisulfito fue completa.
Cuantificación
Los fragmentos digeridos se separan luego mediante electroforesis en gel de poliacrilamida, con la aparición esperada de bandas correspondientes a un único fragmento grande no digerido y múltiples bandas más pequeñas correspondientes a fragmentos digeridos. La cantidad cuantitativa de ADN en estas bandas se puede determinar con un dispositivo como un fosfoimager , después de lo cual se puede calcular el porcentaje de metilación de la muestra original mediante:
Uso y aplicaciones
COBRA se ha utilizado ampliamente en muchas aplicaciones basadas en investigación, como la detección de cambios en la metilación del ADN en promotores genéticos en estudios sobre el cáncer, [3] [4] la detección de patrones de metilación alterados en genes impresos , [5] y la caracterización de patrones de metilación en el genoma durante el desarrollo en mamíferos. [6] [7]
En medicina, COBRA se ha utilizado como herramienta para ayudar a diagnosticar enfermedades humanas que implican metilación aberrante del ADN. Los investigadores utilizaron COBRA junto con cromatografía líquida de alto rendimiento desnaturalizante en el diagnóstico del trastorno de impronta genética síndrome de Russell-Silver, en el que la hipometilación del gen impreso H19 es responsable del trastorno en hasta el 50% de los pacientes. [8]
Fortalezas
Sencillo, rápido y económico : en COBRA, los niveles de metilación del ADN se miden de forma fácil y rápida sin necesidad de realizar subclonaciones y secuenciaciones laboriosas , como ocurre con la secuenciación con bisulfito. El ensayo es sencillo y se puede realizar con reactivos de biología molecular estándar y económicos.
Alta compatibilidad : debido a los pasos de PCR y purificación, el método no solo funciona con cantidades muy pequeñas de ADN genómico, sino también con muestras que han sido tratadas con parafina, las cuales pueden ser un problema en otros protocolos de cuantificación de metilación de ADN, como el Southern blotting y la digestión con enzimas de restricción sensibles a la metilación seguida de PCR.
Cuantitativo : esto contrasta con la PCR específica de metilación , que es cualitativa. Con COBRA, los niveles de metilación del ADN se pueden cuantificar directamente en un locus determinado, lo que proporciona más información por ensayo.
Escalabilidad para el procesamiento de muestras de alto rendimiento : con COBRA, se pueden procesar muchas regiones de interés en paralelo en muestras separadas digeridas con la misma enzima de restricción. Esto contrasta con el análisis de secuenciación con bisulfito, donde cada región debe examinarse rigurosamente mediante la secuenciación de muchos clones por locus, lo que requiere más tiempo.
Consultas múltiples por ensayo : el estado de metilación se puede interrogar en múltiples sitios de restricción que contienen CpG en un solo ensayo de digestión.
Debilidades
El ensayo se limita al uso de sitios de restricción existentes en la región de interés, y no se analizará la metilación que no ocurra en el contexto de un sitio de restricción específico.
La digestión incompleta por enzimas de restricción después de la PCR puede confundir el análisis: la digestión incompleta sugeriría falta de metilación del ADN (si se corta con una enzima sensible a la metilación como HpaII). También se sabe que BstUI puede cortar en sitios no convertidos, lo que lleva a una sobrestimación de los niveles de metilación y, por lo tanto, a menudo se necesita el uso de HpaII. [9]
En muestras complejas, la heterogeneidad del tipo de célula puede confundir el análisis ya que el ADN no se está secuenciando, la heterogeneidad en secuencias de diferentes células en la muestra ( es decir , diferentes poblaciones de células dentro de un tumor) que han adquirido mutaciones en la región interrogada, como cambiar el dinucleótido CG a CA o CT, daría como resultado la pérdida del sitio de restricción dando lugar a una región aparentemente metilada debido a la falta de digestión. Esto sesgaría la cuantificación de los niveles de metilación del ADN en una muestra determinada.
Alternativas
En general, COBRA se combina a menudo con otros análisis de metilación del ADN y se utiliza con frecuencia en la detección inicial de un loci de interés. Si COBRA sugiere patrones de metilación alterados, se pueden aplicar técnicas más rigurosas y laboriosas, como la secuenciación con bisulfito o MeDIP . También se puede utilizar la secuenciación PacBio para detectar la metilación del ADN.
Referencias
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