454 Life Sciences era una empresa de biotecnología con sede en Branford, Connecticut , especializada en secuenciación de ADN de alto rendimiento . Roche la adquirió en 2007 y la cerró en 2013 cuando su tecnología dejó de ser competitiva, aunque la producción continuó hasta mediados de 2016. [1]
454 Life Sciences fue fundada por Jonathan Rothberg [2] y originalmente se conocía como 454 Corporation, una subsidiaria de CuraGen. Por su método de secuenciación genética de bajo costo, 454 Life Sciences recibió la Medalla de Oro del Wall Street Journal a la Innovación en la categoría Biotecnología-Médica en 2005. [3] El nombre 454 era el nombre en código con el que se hacía referencia al proyecto en CuraGen, y los números no tienen ningún significado especial conocido. [4]
En noviembre de 2006, Rothberg, Michael Egholm y sus colegas de 454 publicaron un artículo de portada con Svante Pääbo en Nature describiendo el primer millón de pares de bases del genoma neandertal e iniciaron el Proyecto Genoma Neandertal para completar la secuencia del genoma neandertal en 2009. [5]
A finales de marzo de 2007, Roche Diagnostics adquirió 454 Life Sciences por 154,9 millones de dólares estadounidenses. [6] Siguió siendo una unidad de negocios separada. [7] En octubre de 2013, Roche anunció que cerraría 454 y dejaría de brindar soporte a la plataforma a mediados de 2016. [8]
En mayo de 2007, 454 publicó los resultados del Proyecto "Jim": la secuenciación del genoma de James Watson , codescubridor de la estructura del ADN. [9] [10]
454 Sequencing utilizó un sistema de pirosecuenciación paralela a gran escala capaz de secuenciar aproximadamente 400-600 megabases de ADN por cada ejecución de 10 horas en el Genome Sequencer FLX con reactivos de la serie GS FLX Titanium. [11]
El sistema se basó en la fijación de fragmentos de ADN nebulizados y ligados a adaptadores en pequeñas perlas de captura de ADN en una emulsión de agua en aceite . El ADN fijado a estas perlas se amplificó luego mediante PCR . Cada perla unida al ADN se colocó en un pocillo de ~29 μm en una PicoTiterPlate , un chip de fibra óptica . También se introdujo en el pocillo una mezcla de enzimas como la ADN polimerasa , la ATP sulfurilasa y la luciferasa . Luego, la PicoTiterPlate se colocó en el sistema GS FLX para la secuenciación.
En 2005, 454 lanzó el secuenciador GS20 , el primer secuenciador de ADN de nueva generación del mercado. En 2008, 454 Sequencing lanzó los reactivos de la serie GS FLX Titanium para su uso en el instrumento Genome Sequencer FLX, con capacidad para secuenciar entre 400 y 600 millones de pares de bases por ejecución con longitudes de lectura de entre 400 y 500 pares de bases. A finales de 2009, 454 Life Sciences presentó el sistema GS Junior, una versión de sobremesa del sistema Genome Sequencer FLX. [12]
El ADN genómico se fraccionó en fragmentos más pequeños (300-800 pares de bases) y se pulió (se hizo romo en cada extremo). Luego se ligaron adaptadores cortos a los extremos de los fragmentos. Estos adaptadores proporcionaron secuencias de cebado tanto para la amplificación como para la secuenciación de los fragmentos de la biblioteca de muestras. Un adaptador (Adaptador B) contenía una etiqueta de biotina 5' para la inmovilización de la biblioteca de ADN en perlas recubiertas de estreptavidina . Después de la reparación de la muesca, la hebra no biotinilada se liberó y se utilizó como una biblioteca de ADN de plantilla de cadena sencilla (sstDNA). La biblioteca de sstDNA se evaluó en cuanto a su calidad y la cantidad óptima (copias de ADN por perla) necesaria para emPCR se determina mediante titulación. [13]
La biblioteca de sstDNA se inmovilizó en perlas. Las perlas que contenían un fragmento de la biblioteca portaban una única molécula de sstDNA. La biblioteca unida a las perlas se emulsionó con los reactivos de amplificación en una mezcla de agua en aceite. Cada perla se capturó dentro de su propio microrreactor donde se produce la amplificación por PCR. Esto dio como resultado fragmentos de ADN amplificados clonalmente e inmovilizados en perlas.
Se añadieron perlas de la biblioteca de ADN monocatenario a la mezcla de incubación de perlas de ADN (que contenía ADN polimerasa) y se colocaron en capas con perlas de enzima (que contenían sulfurilasa y luciferasa) en un dispositivo PicoTiterPlate. El dispositivo se centrifugó para depositar las perlas en los pocillos. La capa de perlas de enzima aseguró que las perlas de ADN permanecieran posicionadas en los pocillos durante la reacción de secuenciación. El proceso de deposición de perlas se diseñó para maximizar la cantidad de pocillos que contienen una sola perla de la biblioteca amplificada.
El dispositivo PicoTiterPlate cargado se colocó en el instrumento Genome Sequencer FLX. El subsistema de fluídica entregó reactivos de secuenciación (que contenían tampones y nucleótidos) a través de los pocillos de la placa. Los cuatro nucleótidos de ADN se agregaron secuencialmente en un orden fijo a través del dispositivo PicoTiterPlate durante una ejecución de secuenciación. Durante el flujo de nucleótidos, millones de copias de ADN unidas a cada una de las perlas se secuenciaron en paralelo. Cuando se agregó un nucleótido complementario a la cadena de plantilla en un pocillo, la polimerasa extendió la cadena de ADN existente agregando nucleótido(s). La adición de uno (o más) nucleótido(s) generó una señal de luz que fue registrada por la cámara CCD en el instrumento. Esta técnica se basó en la secuenciación por síntesis y se llamó pirosecuenciación . [14] La intensidad de la señal fue proporcional al número de nucleótidos; por ejemplo, los tramos de homopolímero, incorporados en un flujo de nucleótido único, generaron una señal mayor que los nucleótidos individuales. Sin embargo, la intensidad de la señal para los tramos de homopolímero fue lineal solo hasta ocho nucleótidos consecutivos, después de lo cual la señal disminuyó rápidamente. [15] Los datos se almacenaron en archivos de formato de diagrama de flujo estándar (SFF) para su análisis posterior.
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