El balanol es un metabolito fúngico producido por el hongo Verticillium balanoides . [1] Es un potente inhibidor de las serina/treonina quinasas, proteína quinasa A (PKA) y proteína quinasa C (PKC), y se une de manera similar a la del ATP . [2] Balanol fue descubierto en 1993 en la búsqueda de nuevos inhibidores de la PKC, un miembro de una familia de serina/treonina quinasas cuya sobreactivación está asociada con numerosas enfermedades humanas de transducción de señales, incluido el cáncer. Sin embargo, gran parte de la investigación sobre el balanol se centra en cómo las modificaciones químicas de la estructura molecular afectan la unión a la PKA. [3] De hecho, el balanol, sus análogos químicamente alterados y sus interacciones con la PKA en particular se utilizan para iluminar las funciones de la selectividad y la flexibilidad de las proteínas en la inhibición de las quinasas. Por ejemplo, la estructura cristalina de rayos X del balanol en complejo con PKA se utilizó para conferir selectividad y mejorar la eficacia farmacológica de los inhibidores de H. sapiens Akt ( PKB ), otra serina/treonina proteína quinasa implicada en el correcto funcionamiento. de muchos procesos celulares. [4]
La estructura química se caracterizó inicialmente mediante una combinación de datos de espectroscopia IR , RMN de hidrógeno-1 , RMN de carbono-13 y RMN 2D , y la estructura cristalina del balanol en complejo con PKA se resolvió en 1999. [5] La molécula de balanol consta de tres regiones: una benzofenona , un hexahidroazepano y un resto 4- hidroxibenzoílo . Los restos de benzofenona y hexahidroazepano están conectados mediante un enlace éster, y los restos de azepano y benzoílo están conectados mediante un enlace amida. [6] Además, el balanol a veces se denomina ofiocordina, un agente antifúngico producido por el hongo Cordyceps ophioglossoides cuya estructura es regioisométrica a la del balanol; es decir, en la ofiocordina, la benzofenona está unida al hexahidroazepano a través de una amida; el grupo 4-hidroxibenzoilo y el hexahidroazepano están conectados con un enlace éster. [7]
Balanol es un congénere del ATP , con distintas regiones de su estructura molecular capaces de formar enlaces como el anillo de adenina, la ribosa y los grupos fosfato de la molécula de ATP. Específicamente, el resto 4-hidroxibenzamida del balanol, incluido el conector amida, corresponde a la adenina del ATP, el resto hexahidroazepano a la región ribosa y los anillos de benzofenona a los trifosfatos del ATP. [5]
Se han sintetizado numerosos congéneres de balanol para estudiar el efecto de las modificaciones químicas sobre la unión y la especificidad de la quinasa. Por ejemplo, las modificaciones de los anillos de benzofenona, análogos de los grupos fosfato del ATP, producen inhibidores de la proteína quinasa inusualmente potentes y específicos. [6] Además, muchos de estos congéneres de balanol muestran una especificidad sustancial hacia la PKA sobre la PKC. La eliminación del grupo hidroxilo del anillo de benzofenona (que produce 10"-desoxibalanol), por ejemplo, provoca una selectividad dos órdenes de magnitud mayor para la PKA que para la PKC. [8] También se demostró que la potente actividad inhibidora depende del ácido carboxílico del anillo de benzofenona (que produce 10"-desoxibalanol). anillo de benzofenona y la presencia de un anillo de azepano de cinco o siete miembros [3] .
La estructura flexible de Balanol también juega un papel importante en su selectividad. Específicamente, el anillo de benzofenona distal del balanol puede girar. De hecho, en complejo con PKA, se observó que el anillo de benzofenona distal de balanol era casi ortogonal con el anillo vecino. [5] Esta flexibilidad podría permitir que el balanol se adapte a numerosos microambientes proteicos para ejercer sus propiedades inhibidoras sobre varias proteínas quinasas. La selectividad del balanol por algunas quinasas y no por otras, a su vez, podría representar los distintos grados de flexibilidad permitidas por los sitios catalíticos de unión de ATP de estas quinasas. [6]
Balanol es uno de los inhibidores naturales más potentes de las proteínas quinasas PKC y PKA. [5] Se descubrió originalmente que el balanol inhibía la PKC y muchas de sus isoformas en humanos (α, β-Ι, β-ΙΙ, γ, δ, ε, η), con un perfil de inhibición similar al de la estaurosporina . [1]
Balanol impide su funcionamiento uniéndose competitivamente al dominio catalítico de PKC y PKA con una afinidad ( K i ≥ 4 nM) tres órdenes de magnitud mayor que la del ATP. [6] Sin ATP unido, estas quinasas no pueden catalizar la transferencia del γ-fosfato del ATP al sustrato objetivo de la quinasa y, por lo tanto, su función se ve obstaculizada.
El balanol unido se extiende 17,2 Å desde el átomo de oxígeno hidroxilo de su 4-hidroxibenzamida hasta el átomo de oxígeno carboxilo más distal de su fracción benzofenona, encajando entre los lóbulos catalíticos grande y pequeño de la PKA y extendiéndose desde el borde interior hasta la boca exterior del activo. -sitio hendidura de unión a ATP de la enzima. El bucle rico en glicina y el pequeño lóbulo de la hendidura permiten una unión firme y de ajuste inducido. [5]
Cada subsitio de la bolsa de unión de ATP en la PKA está ocupado por un sustituyente de la molécula de balanol, como se observa en estudios de la subunidad catalítica de PKA en ratón recombinante. [5] El subsitio de adenina de la PKA tiene componentes hidrofóbicos y tiene el potencial de donar y aceptar electrones para formar enlaces de hidrógeno con uno o dos anillos cíclicos planos. Específicamente, el nitrógeno de la cadena principal de Val123 y el átomo de oxígeno carbonílico de Glu121 pueden formar enlaces de hidrógeno con el único grupo hidroxilo del balanol del resto 4-hidroxibenzoílo. En la molécula de ATP, el átomo de hidrógeno de la amida Val123 acepta electrones del átomo N1 del anillo de purina del ATP, mientras que el átomo de oxígeno carbonilo de la cadena principal Glu121 dona electrones al átomo N6 del anillo de purina de ATP. Los miméticos de ATP como el balanol pueden anclarse dentro de la bolsa hidrofóbica de unión a adenina porque sus sustituyentes planos pueden realizar interacciones no polares favorables. El subsitio ribosa está ocupado por el anillo axepano del balanol. Específicamente, el átomo N1 del anillo de azepano se une a los enlaces de hidrógeno con el átomo de oxígeno del carbonilo principal de Glu170 del bucle catalítico. Los átomos dentro del anillo de azepano también pueden establecer contactos no polares favorables con los residuos Gly50, Flu127 y Glu170. Si bien también ocurren otras interacciones, la mayoría de las interacciones polares y no polares involucran al sustituyente benzofenona del balanol, que interactúa con los residuos que comprenden el subsitio de unión al fosfato. Por ejemplo, el anillo de benzofenona del balanol interactúa con numerosos residuos altamente conservados en PKA, como Gly52, Phe54, Asp184, entre otros, además de varios residuos no conservados como Leu74 y Gln84. La mayoría de los residuos conservados en PKA interactúan con el ATP, mientras que no se producen interacciones del ATP con los residuos no conservados. [5]
Seis moléculas de agua ordenadas también desempeñan funciones críticas en la unión del balanol a la PKA. Varios residuos de PKA, como Leu49 y Tyr330, se unen con moléculas de agua conservadas. Estas moléculas de agua también median en las interacciones entre balanol y los residuos de la hendidura catalítica de PKA; por ejemplo, dos moléculas de agua forman un puente para permitir que el átomo N1' de balanol interactúe con el grupo hidroxilo de Tyr330. [5]
Sin embargo, la estrecha interacción del balanol con el sitio de unión de ATP que conduce a la potencia del balanol como inhibidor no se debe a los enlaces de hidrógeno sino a las interacciones no polares predominantes que realiza la molécula. Por ejemplo, los anillos de benzofenona del balanol están colocados al lado del bucle rico en glicina y más lejos del bucle catalítico más polar. En comparación con los trifosfatos de ATP, la acomodación de los anillos de benzofenona del balanol induce la reordenación de las cadenas laterales catalíticas Phe54 y Ser53, lo que permite interacciones polares y no polares favorables y probablemente contribuye al potente efecto inhibidor del balanol sobre estas quinasas. [5]
Como el balanol actúa específicamente en el sitio de unión de ATP en el núcleo catalítico de PKA y PKC, inicialmente se planteó la hipótesis de que el balanol podría inhibir todas las serina/treonina quinasas que comparten un sitio de unión de ATP conservado. Sin embargo, el balanol no inhibe todas las serina/treonina quinasas de manera uniforme. La afinidad por el balanol varía mucho (K i = 1,6 a 742 nM), y varios miembros de la familia de la proteína quinasa serina/treonina no se ven afectados en absoluto, aunque la afinidad de estas quinasas por el ATP varía poco (13 a 60 μM). [6] Balanol exhibe el efecto inhibidor más potente (K i = 1,6–6,4 nM) sobre la proteína quinasa dependiente de cGMP ( PKG ), PKA y PKC, incluidas las isoformas. [6] Ejerce un efecto mucho menor (K i = 30 – 742 nM), si lo hay, sobre las quinasas reguladas por calmodulina Ca 2+ , la proteína quinasa activadora de mitógenos (MAPK/Erk1) y ciertas quinasas dependientes de ciclina. . [6] Además, el balanol no inhibe dos tirosina proteína quinasas, la quinasa SC, ni la quinasa del receptor del factor de crecimiento epidérmico. [2]