CLARITY [1] es un método para hacer que el tejido sea transparente utilizando hidrogeles basados en acrilamida creados desde dentro y unidos al tejido, y como se define en el artículo inicial, representa "la transformación de tejido biológico intacto en una forma híbrida en la que componentes específicos se reemplazan con elementos exógenos que brindan nueva accesibilidad o funcionalidad". [1] Cuando se acompaña con un etiquetado basado en anticuerpos o genes, CLARITY permite obtener imágenes muy detalladas de la estructura de proteínas y ácidos nucleicos de los órganos, especialmente el cerebro . Fue desarrollado por Kwanghun Chung y Karl Deisseroth en la Facultad de Medicina de la Universidad de Stanford . [2]
Varios artículos publicados han aplicado el método CLARITY a una amplia gama de tejidos y estados patológicos, como la inmunooncología para el cáncer de mama humano, [3] cerebros humanos con enfermedad de Alzheimer , [4] médulas espinales de ratones, [5] modelos animales de esclerosis múltiple , [6] y plantas. [7] CLARITY también se ha combinado con otras tecnologías para desarrollar nuevos métodos de microscopía, incluida la microscopía de expansión confocal , la microscopía de lámina de luz SPIM y la microscopía de lámina de luz optimizada para CLARITY (COLM). [8]
El proceso de aplicación de imágenes CLARITY comienza con una muestra de tejido post mortem . Dependiendo del tipo de tejido, pueden ser necesarios pasos de preprocesamiento como la desmineralización o la decoloración después de la fijación de la muestra. A continuación, se debe aplicar una serie de tratamientos químicos para lograr la transparencia, en los que se elimina el contenido lipídico de la muestra, mientras que casi todas las proteínas y ácidos nucleicos originales se dejan en su lugar. [1] El propósito de esto es hacer que el tejido sea transparente y, por lo tanto, susceptible de una investigación microscópica detallada de sus partes funcionales constituyentes (que son predominantemente proteínas y ácidos nucleicos). Para lograr esto, la estructura proteica preexistente debe colocarse en un andamiaje transparente que la preserve, mientras que se eliminan los componentes lipídicos. Este 'andamio' está formado por monómeros de hidrogel como la acrilamida. La adición de moléculas como formaldehído , paraformaldehído o glutaraldehído puede facilitar la unión del andamiaje a las proteínas y ácidos nucleicos que se van a preservar, y la adición de calor es necesaria para establecer los vínculos reales entre los componentes celulares y la acrilamida. [9]
Una vez completado este paso, los componentes proteínicos y de ácido nucleico de las células del tejido diana se mantienen firmemente en su lugar, mientras que los componentes lipídicos permanecen separados. Luego, los lípidos se eliminan durante días o semanas para su difusión pasiva en detergente, o se aceleran mediante métodos electroforéticos a solo horas o días. [10] [11] Los esfuerzos para acelerar mediante métodos electroforéticos siguen sin ser concluyentes en cuanto a la capacidad de no causar daño tisular. A medida que pasan, las propiedades lipofílicas del detergente le permiten recoger y extirpar cualquier lípido que encuentre en el camino. Los colorantes lipófilos como DiI se eliminan, sin embargo, hay colorantes lipófilos compatibles con CLARITY que se pueden fijar a las proteínas vecinas. [12] La gran mayoría de las moléculas no lipídicas, como las proteínas y el ADN, no se ven afectadas por este procedimiento, gracias al gel de acrilamida y las propiedades químicas de las moléculas involucradas. [9]
Como se informó en el artículo inicial, el tejido se expande durante este proceso, pero según sea necesario se puede restaurar a sus dimensiones iniciales con un paso final de incubación en una solución que coincida con el índice de refracción. [1] La expansión del tejido ocurre en el cerebro, que es excepcionalmente rico en lípidos; sin embargo, se ha observado que otros tipos de tejido no experimentan tanta expansión tisular durante todo el proceso.
En esta etapa del proceso, la muestra ya está completamente preparada para la obtención de imágenes. El contraste para la obtención de imágenes puede provenir de moléculas fluorescentes endógenas, de marcadores de ácidos nucleicos (ADN o ARN) o de inmunotinción , en la que se utilizan anticuerpos que se unen específicamente a una determinada sustancia objetivo. Además, estos anticuerpos se etiquetan con marcadores fluorescentes que son la clave para el resultado final de la obtención de imágenes. Los métodos estándar de obtención de imágenes confocales, de dos fotones o de láminas de luz son todos adecuados para detectar la fluorescencia emitida hasta la escala de localización de proteínas, lo que da como resultado las imágenes finales altamente detalladas y tridimensionales que produce CLARITY. [9]
Después de que una muestra ha sido inmunoteñida para una imagen, es posible eliminar los anticuerpos y volver a aplicar otros nuevos, lo que permite tomar imágenes de una muestra varias veces y apuntar a múltiples tipos de proteínas. [13] [14]
En términos de imágenes cerebrales, la capacidad de las imágenes CLARITY para revelar estructuras específicas con un detalle tan claro ha dado lugar a prometedoras vías de aplicaciones futuras, incluyendo el cableado de circuitos locales (especialmente en lo que se refiere al Proyecto Connectome ), las relaciones entre células neuronales, los roles de las estructuras subcelulares, una mejor comprensión de los complejos proteicos y la obtención de imágenes de ácidos nucleicos y neurotransmisores . [1] Un ejemplo de un descubrimiento realizado a través de las imágenes CLARITY es un patrón peculiar de "escalera" donde las neuronas se conectan entre sí y con sus vecinas, que se ha observado en animales que está conectado a comportamientos similares al autismo . [15]
La técnica CLARITY se ha expandido a varias aplicaciones más allá del cerebro. [16] Se han publicado numerosas modificaciones para desarrollar las publicaciones iniciales y se han realizado esfuerzos tanto a nivel académico como dentro de la industria biotecnológica para aplicar aplicaciones de amplio alcance a CLARITY. CLARITY continúa ganando terreno como una tecnología emergente que puede proporcionar información valiosa para el diagnóstico clínico en el futuro. CLARITY se puede utilizar con pocas o ninguna modificación para limpiar la mayoría de los demás órganos, como el hígado, el páncreas, el bazo, los testículos y los ovarios, y otras especies como el pez cebra. Mientras que el hueso requiere un simple paso de descalcificación, de manera similar, el tejido vegetal requiere una degradación enzimática de la pared celular. [10]
El director del NIH, Francis Collins, ya ha expresado sus esperanzas en esta tecnología emergente, diciendo: [17]
"CLARITY es una tecnología potente que permitirá a los investigadores estudiar enfermedades y trastornos neurológicos, centrándose en las estructuras enfermas o dañadas sin perder una perspectiva global. Es algo que nunca antes habíamos podido hacer en tres dimensiones".
—Francis Collins
Aunque el procedimiento CLARITY ha alcanzado niveles sin precedentes de retención de proteínas después de la extracción de lípidos, la técnica aún pierde aproximadamente un 8% de proteínas por instancia de electroforesis con detergente. [13] La obtención repetida de imágenes de una sola muestra solo amplificaría esta pérdida, ya que la eliminación de anticuerpos se logra comúnmente a través del mismo proceso de detergente que crea la muestra original. [9] Sin embargo, esos cálculos parecen carecer de un método consistente para la pérdida total de proteínas a lo largo del experimento. ClearLight Biotechnologies, una empresa fundada por Karl Deisseroth, descubrió que el proceso de detergente publicado originalmente para la eliminación de anticuerpos no era el enfoque ideal y desarrolló una solución decolorante que no era tan perjudicial para la integridad del tejido.
Otras posibles desventajas de la técnica son el tiempo que lleva crear y obtener la imagen de una muestra (la tinción inmunohistoquímica por sí sola tarda hasta seis semanas en realizarse) y el hecho de que la acrilamida utilizada es altamente tóxica y cancerígena . El tiempo se ha citado a menudo como un factor limitante y una desventaja para el uso de la técnica CLARITY; sin embargo, varias empresas académicas y de biotecnología (Logos Bioscience, ClearLight Biotechnologies) han seguido desarrollando y optimizando los reactivos CLARITY que acortaron significativamente el tiempo de inmunotinción reduciendo el proceso de seis semanas a tan solo una semana según el tipo de muestra. Todas las aclaraciones de tejido tienen sus propios problemas de seguridad. Si bien la acrilamida se considera tóxica y cancerígena, sus componentes son similares a los que se encuentran en los geles utilizados para las transferencias Western.