La tomografía electrónica criogénica ( cryoET ) es una técnica de imágenes utilizada para reconstruir volúmenes tridimensionales de alta resolución (~1–4 nm) de muestras, a menudo (pero no limitado a) macromoléculas biológicas y células . [1] [2] cryoET es una aplicación especializada de criomicroscopía electrónica de transmisión (CryoTEM) en la que se toman imágenes de las muestras a medida que se inclinan, lo que da como resultado una serie de imágenes 2D que se pueden combinar para producir una reconstrucción 3D, similar a una tomografía computarizada del cuerpo humano. A diferencia de otras técnicas de tomografía electrónica , las muestras se toman imágenes en condiciones criogénicas (< −150 °C). Para el material celular, la estructura se inmoviliza en hielo vítreo no cristalino , lo que permite tomar imágenes de ellas sin deshidratación o fijación química , que de otro modo alterarían o distorsionarían las estructuras biológicas. [3] [4]
En la microscopía electrónica (EM), las muestras se obtienen imágenes en un alto vacío . Este vacío es incompatible con muestras biológicas como las células; el agua herviría y la diferencia de presión haría explotar la célula. En las técnicas EM a temperatura ambiente, las muestras se preparan por fijación y deshidratación. Sin embargo, otro enfoque para estabilizar las muestras biológicas es congelarlas ( criomicroscopía electrónica o crioEM). Al igual que en otras técnicas de criomicroscopía electrónica, las muestras para crioET (normalmente células pequeñas como Bacterias , Archaea o virus ) se preparan en medios acuosos estándar y se aplican a una rejilla EM. A continuación, la rejilla se sumerge en un criógeno (normalmente etano líquido ) de forma tan eficiente que las moléculas de agua no tienen tiempo de reorganizarse en una red cristalina . [3] El estado acuoso resultante se denomina "hielo vítreo" y preserva las estructuras celulares nativas, como las membranas lipídicas , que normalmente se destruirían por congelación. Las muestras congeladas por inmersión se mantienen posteriormente a temperaturas de nitrógeno líquido durante el almacenamiento y la obtención de imágenes para que el agua nunca se caliente lo suficiente como para cristalizarse.
Las muestras se toman en un microscopio electrónico de transmisión (MET). Como en otras técnicas de tomografía electrónica , la muestra se inclina en diferentes ángulos con respecto al haz de electrones (normalmente cada 1 o 2 grados, desde aproximadamente −60° hasta +60°), y se adquiere una imagen en cada ángulo. [5] Esta serie de imágenes inclinadas se puede reconstruir luego computacionalmente para obtener una vista tridimensional del objeto de interés. [6] Esto se denomina tomograma o reconstrucción tomográfica .
Uno de los beneficios más citados de la crioET es la capacidad de reconstruir volúmenes 3D de objetos individuales (proteínas, células, etc. ) en lugar de necesitar múltiples copias de la muestra en métodos cristalográficos o en otros métodos de obtención de imágenes crioEM como el análisis de partículas individuales . [7] La crioET se considera un método in situ cuando se utiliza en una célula no perturbada u otro sistema, ya que la congelación por inmersión fija la muestra en su lugar lo suficientemente rápido como para provocar cambios mínimos en el posicionamiento atómico. [8]
En la microscopía electrónica de transmisión (MET), debido a que los electrones interactúan fuertemente con la materia , las muestras deben mantenerse muy delgadas para no causar que las muestras se oscurezcan debido a múltiples eventos de dispersión elástica . Por lo tanto, en cryoET, las muestras generalmente tienen un espesor menor a ~500 nm. Por esta razón, la mayoría de los estudios de cryoET se han centrado en complejos macromoleculares purificados , virus o células pequeñas como las de muchas especies de bacterias y arqueas. [1] Por ejemplo, cryoET se ha utilizado para comprender la encapsulación de nanopartículas de jaula de proteínas de tamaño de 12 nm dentro de nanopartículas similares a virus de tamaño de 60 nm. [9]
Las células más grandes, e incluso los tejidos, se pueden preparar para la crioET mediante el adelgazamiento, ya sea mediante criosección o mediante fresado con haz de iones enfocado (FIB). En el criosección, los bloques congelados de células o tejido se seccionan en muestras delgadas con un criomicrótomo . [ 11] En el fresado con FIB, las muestras congeladas por inmersión se exponen a un haz de iones enfocado, típicamente galio , que elimina con precisión el material de la parte superior e inferior de una muestra, dejando una lámina delgada adecuada para la obtención de imágenes mediante crioET. [12]
Para las estructuras que están presentes en múltiples copias en uno o varios tomogramas, se puede obtener una resolución más alta (incluso ≤1 nm) mediante el promedio de subtomogramas. [13] [14] De manera similar al análisis de partículas individuales, el promedio de subtomogramas combina computacionalmente imágenes de objetos idénticos para aumentar la relación señal-ruido .
Se sabe que la microscopía electrónica desintegra rápidamente las muestras biológicas en comparación con las muestras de la ciencia y la física de los materiales debido al daño por radiación . [15] En la mayoría de los demás métodos basados en microscopía electrónica para obtener imágenes de muestras biológicas, la combinación de la señal de muchas copias de muestra diferentes ha sido la forma general de superar este problema ( por ejemplo, cristalografía, análisis de partículas individuales). En la crioET, en lugar de tomar muchas imágenes de diferentes copias de muestra, se toman muchas imágenes de un área. En consecuencia, la fluencia (número de electrones impartidos por unidad de área) en la muestra es alrededor de 2-5 veces mayor que en el análisis de partículas individuales. [16] La tomografía en materiales mucho más resistentes permite una resolución drásticamente mayor que la obtención de imágenes biológicas típicas, lo que sugiere que el daño por radiación es la mayor limitación de la crioET de muestras biológicas. [7] [17]
La fuerte interacción de los electrones con la materia también produce un efecto de resolución anisotrópica. A medida que la muestra se inclina durante la obtención de imágenes, el haz de electrones interactúa con una muestra aparente más gruesa a lo largo del eje óptico del microscopio en ángulos de inclinación más altos. En la práctica, los ángulos de inclinación mayores de aproximadamente 60–70° no brindan mucha información y, por lo tanto, no se utilizan. Esto da como resultado una "cuña faltante" de información en la tomografía final que disminuye la resolución paralela al haz de electrones. [6]
El término "cuña faltante" se origina a partir de la vista de la transformada de Fourier del tomograma, donde una cuña vacía es evidente debido a que la muestra no está inclinada a 90°. La cuña faltante da como resultado una falta de resolución en la profundidad de la muestra, ya que la información faltante se encuentra principalmente a lo largo del eje z. La cuña faltante también es un problema en la cristalografía electrónica 3D , donde generalmente se resuelve fusionando múltiples conjuntos de datos que se superponen entre sí o mediante la expansión de simetría cuando sea posible. [15] Ambas soluciones se deben a la naturaleza de la cristalografía, por lo que ninguna se puede aplicar a la tomografía.
Un obstáculo importante en cryoET es la identificación de estructuras de interés dentro de entornos celulares complicados. Soluciones como la microscopía óptica de criofluorescencia correlacionada [ 19] y la microscopía óptica de súper resolución (por ejemplo, cryo-PALM [20] ) se pueden integrar con cryoET. En estas técnicas, una muestra que contiene una proteína de interés marcada con fluorescencia se congela por inmersión y primero se capturan imágenes en un microscopio óptico equipado con una platina especial para permitir que la muestra se mantenga a temperaturas de subcristalización (< −150 °C). Se identifica la ubicación de la señal fluorescente y la muestra se transfiere al CryoTEM, donde luego se capturan imágenes de la misma ubicación a alta resolución mediante cryoET.